奶牛瓣胃上皮细胞对小肽的吸收机制及小肽转运载体1的特征研究

发布时间：2017-05-26 09:28

  本文关键词：奶牛瓣胃上皮细胞对小肽的吸收机制及小肽转运载体1的特征研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前体物,并且能被胃肠道大量吸收。本研究围绕奶牛瓣胃上皮细胞(Omasal epithelial cells, OEC)及小肽转运载体1 (Peptide transporter 1, PepT1),探索瓣胃及PepT1吸收小肽的机制。首先,成功建立了奶牛OEC体外培养模型；其次,研究了OEC对小肽摄取和转运的机制,发现PepTl在奶牛OEC吸收小肽过程中发挥着重要作用；最后,比对分析了奶牛PepT1 (bovine PepT1, bPepT1)的结构特征,并对其表达功能特征和分布规律进行了研究。主要研究结果如下：1.奶牛OEC体外培养模型的建立及其功能检测该部分旨在建立奶牛OEC体外培养模型。瓣胃组织取自4头新生的中国荷斯坦犊牛,采用2.5%胰蛋白酶连续消化分离得到游离细胞,将细胞培养在含10%血清、10ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL庆大霉素和2.5 μg/mL两性霉素B的DMEM高糖培养基中,通过HE组织染色发现瓣胃上皮层已完全被消化酶分离下来。利用酶差消化法和相差贴壁法对OEC进行纯化,纯化后的OEC呈现典型的上皮细胞铺路石状形态特征,纯度达90%以上。通过免疫荧光染色检测到上皮细胞内角蛋白CKl8和PepT1的表达,通过反转录PCR方法在上皮细胞中检测到存在PepT1的mRNA表达,通过扫描电镜和透射电镜观察到上皮细胞表面存在微绒毛,并且在细胞间有桥粒、紧密连接结构、基底层折叠和张力细丝等典型上皮细胞的结构出现,并存在极化现象；细胞具有典型的“S”型细胞增长曲线,且至少可传至10代。通过对OEC摄取2.5 mM二肽glycylsarcosine (Gly-Sar,甘氨酸-肌氨酸)功能进行研究,结果发现OEC可完整地摄取Gly-Sar并呈现pH依赖性(最佳pH 5.5-6.5)、时间依赖性(在10 min时达到饱和)、浓度依赖性和温度依赖性；此外还发现Gly-Sar在浓度较低时(1.5 mM),通过PepT1载体途径的转运量较大,说明低浓度小肽存在时PepTl更易发挥作用。另外,这种摄取可以被Met-Gly二肽竞争性的抑制,而不被游离氨基酸(Free amino acid, FAA)抑制。综上所述,OEC体外培养模型已成功建立,并且PepT1在其摄取小肽过程中发挥着重要作用,所培养的OEC可以作为体外研究瓣胃小肽吸收功能的模型。2. PepTl在奶牛OEC吸收二肽中的功能及影响因素该部分旨在研究奶牛OEC对Gly-Sar的摄取、转运及其影响因素,探讨PepTl基因在OEC吸收小肽过程中发挥的作用。免疫荧光化学检测发现铺满的OEC细胞层有紧密连接蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达,尤其在细胞连接处表达量更多；检测铺于Transwell滤膜OEC细胞层的电阻值和渗透性发现细胞层的电阻值在一周时达到平台期,荧光素钠的渗透率为0.63%,显著低于对照组(无细胞组,12%),说明细胞层已紧密形成,可以进行转运试验。通过控制孵育细胞的温度、pH、时间、浓度、二乙烯焦碳酸酯(DEPC)和竞争肽及LPS的存在与否等不同条件,检测下室中的小肽量,结果发现OEC在37℃时的转运量显著高于4℃(P0.05),并具有pH依赖性,OEC对Gly-Sar的摄取和转运可以被PepTl的His残基抑制剂DEPC显著抑制(P0.05),也可被其他竞争性二肽抑制(P0.05),但不被FAA抑制；从上室转运到下室的小肽量为反方向的3倍,说明小肽转运存在方向性。另外,siRNA特异性的干扰OEC的PepTl基因表达可显著降低其对Gly-Sar的吸收(P0.05),然而过表达OEC的PepTl可以显著增加Gly-Sar的吸收(P0.05)；此外结果还发现不同种类(Gly-Sar、Lys-Lys和Met-Lys)和不同浓度(0.25 mM、2.5 mM和10 mM)的小肽可显著提高OEC的PepT1蛋白表达量(P0.05)。此外,结果还发现LPS可以上调PepT1基因的表达,降低膜电阻,增加OEC对小肽的转运量；另外,通过对瘤胃上皮细胞层与OEC细胞层的小肽转运能力进行比较,发现瓣胃上皮的小肽转运能力显著高于瘤胃。综上所述,PepT1基因可能在奶牛OEC吸收小肽过程中起着重要作用,并受LPS的影响。3.奶牛PepT1的功能表达和分布规律通过对克隆的全长奶牛bPepT1氨基酸序列与其他25个物种进行序列比对和结构预测分析,发现bPepT1与其他物种PepT1的氨基酸序列具有较高的同源性,同源性由高到低依次为山羊(96.2%)、绵羊(95.2%)、马(85.9%)、猪(85.6%)、狗(83.4%)、人(83.0%)、鼠类(82%-83%)、猴类(81%-83%)、兔(78.6%)、禽类(64%)、鱼类(56%-61%)；奶牛bPepT1蛋白结构中含有12个跨膜区、2个PKA位点、4个PKC位点和6个N连接糖基化位点,并且在跨膜区9和10间存在一个大胞外环。利用Western blot分析了奶牛bPepTl的胃肠道组织分布规律,发现空肠和回肠的bPepT1蛋白表达量显著高于其他部位(P0.05),表达量最低的部位为瘤胃,奶牛bPepT1蛋白表达量从高到低依次为：空肠回肠十二指肠瓣胃瘤胃,说明奶牛空肠和回肠可能具有较前胃更强的小肽转运能力。另外,将真核表达载体pcDNA3.1/bPepTl转染到中国仓鼠卵母(CHO)细胞内,并成功表达了bPepTl基因和功能,转染的CHO细胞对0.02 mM同位素标记的[3H]-Gly-Sar的摄取在10 min时达到饱和,并存在pH依赖性,最佳摄取pH为6.5-7.0(pH梯度为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)；存在浓度依赖性(浓度梯度为：0.02-10 mM),米氏常数Km(代表亲和力)为0.94±0.06 mM,最大转运速率Vmax为20.80±1.74 nmol/(mg protein·5 min),属于低亲和力高容量载体。通过检测其他16种含Met和Lys等EAA的小肽的IC50(抑制[3H]-Gly-Sar吸收量一半时所需要抑制肽的浓度,IC50越大表示亲和力越小),发现bPepTl对不同小肽的亲和力不同,其中11种小肽的IC50在0.014-0.096 mM之间(Trp-Phe. Met-Lys、Met-Glu、Gly-Met、Lys-Met、Met-Gly、Gly-Lys、Met-Leu、Lys-Phe、 Met-Met和Met-Leu-Phe),说明bPepTl对这些小肽有很高的亲和力；另外4种小肽(Lys-Lys、Leu-Gly-Gly、Lys-Trp-Lys和Met-Gly-Met-Met)的IC50大于2.069mM,说明它们不易被bPepT1转运,其中Lys-Lys几乎不被转运(IC50大于10mM)；此外,在FAA存在时并没有抑制现象。总之,本试验是初次系统研究奶牛bPepT1的表达功能特点,并发现bPepT1可广泛转运二肽和三肽,对C端含Lys的肽、含正电荷的肽、长链肽不易转运,并具有种属特异性。综上所述,本文成功建立了体外研究奶牛小肽吸收的OEC培养模型,发现bPepT1在OEC吸收小肽过程中发挥了重要作用,并且奶牛PepT1可广泛转运二肽和三肽,且有种属特异性。
【关键词】：奶牛 瓣胃上皮细胞 Gly-Sar 小肽 吸收转运 PepT1 表达功能
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823
【目录】：

• 缩略语一览表12-14
• 中文摘要14-17
• ABSTRACT17-21
• 第一章 文献综述21-51
• 第一节 小肽的作用及其在反刍动物前胃中的吸收21-31
• 1.1 小肽吸收意义21-23
• 1.2 反刍动物前胃与门静脉小肽数量23-24
• 1.3 反刍动物前胃对小肽的吸收24-26
• 1.4 小肽吸收机制26-28
• 1.5 生物活性肽28-31
• 第二节 小肽转运载体(PepT1)的结构特点及分布规律31-39
• 2.1 PepT1的结构特点31-33
• 2.2 PepT1的转运机制33
• 2.3 PepT1的克隆表达33-34
• 2.4 PepT1的底物特异性34-36
• 2.5 PepT1的分布规律36-39
• 第三节 PepT1表达和功能的影响因素39-43
• 3.1 疾病39
• 3.2 昼夜节律39-40
• 3.3 miRNA40
• 3.4 激素40-41
• 3.5 发育41-42
• 3.6 日粮42-43
• 第四节 小肽吸收转运的研究模型43-49
• 4.1 动物模型43
• 4.2 组织模型43-44
• 4.3 刷状缘膜囊泡44
• 4.4 细胞系44-46
• 4.5 原代细胞46-49
• 第五节 研究目的意义与内容49-51
• 5.1 本研究的目的和意义49
• 5.2 本研究的主要内容49-51
• 第二章 奶牛瓣胃上皮细胞(OEC)体外培养模型的建立51-69
• 引言51
• 1 材料51-53
• 1.1 瓣胃组织来源及取样51
• 1.2 主要试剂及配制51-52
• 1.3 主要仪器和耗材52-53
• 2 方法53-58
• 2.1 细胞培养条件53
• 2.2 细胞原代分离53
• 2.3 苏木精和伊红(H&E)组织染色53-54
• 2.4 细胞纯化传代54
• 2.5 细胞冻存与复苏54
• 2.6 细胞生长曲线54-55
• 2.7 OEC超微结构观察55
• 2.8 免疫细胞化学鉴定55
• 2.9 OEC的PepT1基因检测55-58
• 3 结果与分析58-66
• 3.1 原代OEC生长和形态观察58-61
• 3.2 OEC生长曲线61-62
• 3.3 OEC超微结构观察62-63
• 3.4 OEC的鉴定和PepT1的检测63-65
• 3.5 PepT1引物特异性65-66
• 4 讨论66-69
• 第三章 奶牛OEC对Gly-Sar吸收机制的研究69-115
• 引言69
• 第一节 奶牛OEC对Gly-Sar的胞内摄取机制研究69-81
• 1. 材料69-70
• 1.1 OEC69
• 1.2 试剂69-70
• 1.3 仪器70
• 2 方法70-73
• 2.1 细胞培养70
• 2.2 试验设计和处理70-71
• 2.3 蛋白测定71-72
• 2.4 底物对OEC PepT1表达的影响72
• 2.5 Western blot72-73
• 2.6 数据处理与统计73
• 3 结果与分析73-77
• 3.1 OEC对Gly-Sar摄取的pH和时间依赖性73-74
• 3.2 OEC对Gly-Sar摄取的温度和浓度依赖性74-75
• 3.3 Met-Gly与DEPC对OEC摄取Gly-Sar的抑制作用75-76
• 3.4 底物对OEC PepT1表达的影响76-77
• 4 讨论77-81
• 第二节 奶牛OEC对Gly-Sar跨膜转运功能的研究81-101
• 引言81
• 1 材料81
• 1.1 OEC81
• 1.2 试剂81
• 1.3 仪器81
• 2 方法81-86
• 2.1 细胞培养81-82
• 2.2 细胞层紧密性的检测82-83
• 2.3 OEC对Gly-Sar的跨膜转运功能研究83-84
• 2.4 LPS对OEC的PepT1表达和Gly-Sar转运的影响84-85
• 2.5 瘤胃上皮细胞(REC)与OEC小肽转运能力比较85
• 2.6 数据处理与统计85-86
• 3 结果与分析86-97
• 3.1 OEC细胞层致密性的评价86-89
• 3.2 Gly-Sar转运的影响因素89-92
• 3.3 LPS对OEC的PepT1表达和转运功能的影响92-94
• 3.4 瘤胃和OEC转运Gly-Sar能力比较94-97
• 4 讨论97-101
• 4.1 OEC细胞层结构完整性的评估97-98
• 4.2 OEC细胞层对Gly-Sar转运功能的研究98-99
• 4.3 LPS对OEC的PepT1表达和转运功能的影响99-100
• 4.4 REC和OEC转运Gly-Sar能力比较100-101
• 第三节 siRNA干扰与过表达PepT1对OEC摄取Gly-Sar的影响101-115
• 1 材料101
• 1.1 细胞101
• 1.2 试剂101
• 1.3 仪器101
• 2 方法101-105
• 2.1 细胞培养101
• 2.2 转染效率检测101-102
• 2.3 siRNA干扰条件的筛选102-103
• 2.4 siRNA干扰对OEC摄取G砂Sar的影响103
• 2.5 siRNA干扰效果检测103
• 2.6 过表达PepT1对OEC摄取Gly-Sar的影响103-105
• 3 结果与分析105-112
• 3.1 转染条件的优化105-108
• 3.2 siRNA干扰对OEC摄取Gly-Sar的影响108-109
• 3.3 过表达PepT1对OEC摄取Gly-Sar的影响109-112
• 4 讨论112-115
• 第四章 奶牛小肽转运载体PepT1的功能特征及组织分布115-151
• 1 材料115
• 1.1 细胞系115
• 1.2 试剂115
• 1.3 仪器115
• 2 方法115-118
• 2.1 奶牛全长bPepT1的克隆与真核表达载体的构建115
• 2.2 奶牛bPepT1蛋白结构预测115-116
• 2.3 奶牛bPepT1与其他物种的同源性比较116
• 2.4 奶牛胃肠道bPepT1的分布规律116
• 2.5 细胞培养116-117
• 2.6 CHO细胞的转染117
• 2.7 qPCR检测bPepT1的表达117
• 2.8 转染CHO细胞的PepT1表达功能117-118
• 2.9 液闪移检测118
• 2.10 数据统计分析118
• 3 结果与分析118-144
• 3.1 奶牛bPepT1蛋白结构118-135
• 3.2 奶牛胃肠道组织bPepT1的分布规律135-136
• 3.3 奶牛bPepT1的功能特征136-144
• 4 讨论144-151
• 4.1 bPepT1的结构特点144-146
• 4.2 奶牛胃肠道组织bPepT1的分布规律146
• 4.3 bPepT1的功能特点146-148
• 4.4 bPepT1对不同小肽的转运动力学研究148-151
• 第五章 结论、创新点与研究展望151-153
• 1 主要结论151
• 2 创新点151-152
• 3 研究展望152-153
• 参考文献153-177
• 作者简历及论文发表情况177-179
• 致谢179

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 姜宁;张爱忠;苗树君;陈景华;韩华;;补充不同处理蛋氨酸和小肽及对奶牛产奶性能和营养物质消化率的影响[J];中国牛业科学;2006年04期

2 李燕;林雪彦;姜运良;苏鹏程;王中华;;应用RT-PCR方法检测牛消化道各段Ⅰ型肽载体mRNA差异表达的研究[J];动物营养学报;2008年02期

3 曹志军,李胜利,丁志民;日粮中添加小肽对奶牛产奶性能影响的研究[J];饲料工业;2004年04期

4 井龙晖;张瑞阳;朱伟云;毛胜勇;;颈静脉灌注脂多糖对奶牛外周血循环中蛋白质、脂质和氨基酸浓度的影响[J];动物营养学报;2013年12期

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 赵珂;奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取的调控及其对乳成分合成的影响研究[D];浙江大学;2011年

2 王岗;绵羊小肠寡肽吸收规律的研究[D];内蒙古农业大学;2001年

3 孙冬黎;小肽转运体POTs在前列腺和脾脏及巨噬细胞的功能性表达研究[D];浙江大学;2012年

4 于志鹏;蛋清源活性肽的结构鉴定及生物活性研究[D];吉林大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 李燕;牛I型肽载体（BPepT1）的克隆及在消化道组织中的表达分析[D];山东农业大学;2006年

2 戴燕青;稳定表达人寡肽转运体1的细胞模型构建及应用[D];浙江大学;2013年

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本文编号：396418