小鼠卵母细胞玻璃化冷冻对DNA甲基化的影响

发布时间：2017-05-26 11:28

  本文关键词：小鼠卵母细胞玻璃化冷冻对DNA甲基化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为探讨玻璃化冷冻保存对卵母细胞DNA甲基化的影响,本实验首先研究了小鼠M Ⅱ期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后印记基因H19,Peg3和Snrpn差异甲基化区域DNA甲基化状态,同时研究了卵母细胞解冻后与DNA甲基化相关酶的相对表达量。结果表明,和新鲜卵细胞相比,小鼠成熟的卵母细胞玻璃化冷冻解冻后其基因组印记基因H19,Peg3和Snrpn差异甲基化区域DNA甲基化模式并没有发生改变,与DNA甲基化相关的酶Dnmtl,Dnmt3a,Dnmt3b和Dnmt3l相对表达量均显著下降(P0.05),与DNA去甲基化相关的酶Tet3相对表达量显著下降(P0.05)。 其次,检测了冷冻卵母细胞经体外受精获得的囊胚基因组中印记基因H19,Peg3和Snrpn差异甲基化区域的DNA甲基化模式,以及DNA甲基化转移酶和二种与DNA去甲基化相关的酶(Tetl,Tet2和Tet3)的相对表达量。结果显示,H19DMR整体甲基化水平在冷冻组(30.95%)和新鲜组(32.15%)之间差异不显著(P0.05),冷冻组Peg3DMR平均甲基化水平为30.19%显著低于新鲜组(35.38%)(P0.05),冷冻组Snrpn DMR平均甲基化水平为]8.13%显著低于新鲜组(35.48%)(P0.05)。两组间Dnmtl,Dnmt3a,和IDnmt3l相对表达量差异不显著(P0.05),冷冻组Dnmt3b相对表达量显著低于新鲜组(P0.05)。冷冻组Tetl,Tet2和Tet3的相对表达量和新鲜组相比差异不显著(P0,05)。 继而探讨了玻璃化冷冻卵母细胞产生的DNA甲基化模式的改变能否影响到后续植入胚胎原始生殖细胞中的DNA甲基化重编程,由冷冻卵母细胞经体外受精得到的2-cell胚胎移植到受体鼠内,检测了E13.5胚胎中原始生殖细胞基因组中印记基因H19,Peg3和Snrpn的差异甲基化区域的DNA甲基化模式,以及反转座子的重复序列Linel-5'和IAP-LTR的DNA甲基化状态。结果显示,(])E13.5雌性胚胎原始生殖细胞中H19差异甲基化区域的DNA甲基化平均水平其冷冻组(3.34%)显著低于新鲜组(16.44%)(P0.05),而在雄性胚胎原始生殖细胞中两者无显著性差异,均处于完全的未甲基化状态；(2)在冷冻组中,雌性胚胎原始生殖细胞Peg3DMR仍有5.88%的DNA甲基化,和新鲜组(0%)相比差异显著(P0.05),而冷冻组雄性胚胎原始生殖细胞Peg3DMR DNA甲基化水平为41.97%显著高于新鲜组(0%)(P0.05)；(3)Snrpn差异甲基化区域的DNA甲基化状态在E13.5时,雌性和雄性胚胎原始生殖细胞中均处于未甲基化状态；(4)冷冻组E13.5雌性胚胎原始生殖细胞中Linel-5'位点的DNA甲基化平均值为38.02%,和新鲜组(36.51%)之间无显著性著异。而雄性胚胎原始生殖细胞中,其冷冻组的DNA甲基化水平(14.03%)显并高于新鲜组(6.25%)(P0.05)；(5)冷冻组雌性胚胎原始生殖细胞IAP-LTR位点的DNA甲基化水平(36.37%)显著低于新鲜组雌性(48.18%),而在冷冻组雄性胚胎原始生殖细胞中,此位点的DNA甲基化水平(93.93%)显著高于新鲜组(57.14%)(P0.05)。 综上所述,小鼠MⅡ期卵母细胞经玻璃化冷冻后不会影响其印记基因差异甲基化区域DNA甲基化,但冷冻后卵母细胞会导致DNMTs和TETs mRNA相对含量下降；由冷冻卵母细胞得到的囊胚其印记基因DNA甲基化水平显著降低,且影响Dnmt3b的表达量。由冷冻卵母细胞得到的胚胎原始生殖细胞Peg3DMR甲基化模式异常,并导致反转座子的重复序列DNA模式异常。
【关键词】：小鼠卵母细胞 玻璃化冷冻 DNA甲基 印记基因 反转座子
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 插图与附表清单11-13
• ~.略语表13-14
• 第一部分 文献综述14-34
• 综述一 哺乳动物卵母细胞冷冻保存技术研究进展14-23
• 1.1 冷冻的基本原则14
• 1.2 冷冻保存细胞的首次应用14-15
• 1.3 慢速冷冻和玻璃化冷冻的发展15-16
• 1.4 卵母细胞冷冻保存16-18
• 1.5 卵母细胞冷冻保存损伤的研究18-21
• 1.6 卵母细胞冷冻研究展望21-23
• 综述二 哺乳动物的DNA甲基化23-34
• 2.1 与DNA甲基化和去甲基化相关的酶24-28
• 2.2 基因印记中的DNA甲基化28-32
• 2.3 转座因子的DNA甲基化32-33
• 2.4 展望33-34
• 第二部分 研究论文34-66
• 实验一 玻璃化冷冻卵母细胞对印记基因DNA甲基化的影响34-47
• 摘要34
• 3.1 引言34-35
• 3.2 材料和方法35-43
• 3.3. 结果43-45
• 3.4 讨论45-47
• 实验二 玻璃化冷冻卵母细胞对其形成的囊胚印记基因DNA甲基化的影响47-55
• 摘要47
• 4.1 前言47-48
• 4.2 材料和方法48-50
• 4.3 结果50-53
• 4.4 讨论53-55
• 实验三 玻璃化冷冻卵母细胞对E13.5原始生殖细胞DNA甲基化的影响55-66
• 摘要55
• 5.1 前言55-56
• 5.2 材料和方法56-60
• 5.3 结果60-64
• 5.4 讨论64-66
• 结论66-67
• 参考文献67-80
• 致谢80-81
• 个人简历81

【共引文献】

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