控制菌根共生效率玉米基因的定位与功能互补

发布时间：2017-05-26 12:11

  本文关键词：控制菌根共生效率玉米基因的定位与功能互补，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：玉米(Zea mays L.)不但是重要的粮食作物,还是重要的饲料来源、工业原料,在粮食供给和经济发展方面起着不可或缺的作用。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一种最常见的内生菌根真菌,能与80%以上的陆地植物形成互惠共生体—丛枝菌根 (Arbuscular mycorrhiza, AM), AM不仅能够促进植物对水分和矿质元素特别是P素的吸收,改善植物营养状况,还能增强植物对生物和非生物胁迫的抗性,从而提高植物的产量和质量。高共生效率是丛枝菌根共生体系的关键起始因素,目前国内外对AMF与玉米间互作的研究集中在抗盐、抗旱、抗重金属污染等领域,而针对玉米同AMF共生效率的研究还未有报道,尚未从玉米遗传种质中鉴定出控制玉米同AMF共生效率的基因。随着单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)标记技术的发展,基于连锁不平衡(LD)的全基因组关联分析(GWAS)为复杂数量性状的研究开辟了新途径。本研究利用380份玉米自交系,对玉米同AMF共生效率的性状进行了GWAS分析,定位到一个主效基因并对其进行了功能验证,为进一步利用基因资源开展分子标记育种提供了研究目标。本研究发现,同番茄相比,玉米B73接种丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis也能够建立良好的共生关系,根系侵染率达到50%。同促进番茄生长类似,R. irregularis可显著提高B73的茎长、地上部鲜重,同时提高B73对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)的抗性。商品化玉米郑单958和先玉335的R. irregularis根系侵染率都低于10%,盆栽实验和大田实验共同证实,R. irregularis对郑单958和先玉335的茎长、茎粗和玉米产量都无显著影响。说明菌根真菌在玉米上的有效利用,首先需要从遗传上改良共生效率。为鉴定玉米中影响玉米与丛枝菌根真菌共生关系的关键基因,我们选取了380份玉米自交系并接种R. irregularis,调查了共生效率。发现AMF在这些自交系中的侵染率分布为0%～100%,遗传差异显著。以侵染率作为遗传表型,利用覆盖全基因组的550000个SNP标记,对其中数据完善的303份玉米材料的根系侵染率进行全基因组关联分析。通过比较四个模型GLM模型、Q模型、K模型和Q+K模型,发现Q模型最适合进行全基因组关联分析。在Q模型下,共检测到27个显著性SNPs,分布在位于第2、4、5、7号不同染色体上的5个基因(MSERG1～5,P1×10-4)上,这5个基因确定为控制玉米与R. irregularis共生效率相关基因的候选基因。以显著性最高的MSERG 4基因为研究对象,从玉米突变体库中检索到3个等位突变体,通过对鉴定的纯合突变体进行接种R. irregularis并分析共生效率,同野生型相比,MSERG 4-1, MSERG4-2和MSERG 4-3在接种R. irregularis后,根系AMF侵染率极显著提高,从而证明MSERG 4基因与R. irregularis同与玉米的共生效率相关。进一步的研究表明,突变体叶片中无机磷含量下降,茎中含量显著升高,而根中则显著降低。说明MSERG 4不仅能够负调控玉米根系与AMF的共生关系,并能影响菌根玉米植株中无机磷的分布,这暗示MSERG 4很可能通过影响植物对无机磷的吸收来调控共生过程。由于AMF与作物共生具有广谱性特点,为探讨MSERG 4基因参与调节共生效率的功能在不同物种中是否具有保守功能,我们通过同源比对的方法确定了水稻、烟草、番茄中的同源基因,并利用突变体或RNAi遗传转化的方法鉴定和创制了遗传材料,为后期验证相关基因的功能积累了材料。
【关键词】：玉米 丛枝菌根真菌 根系侵染率 全基因组关联分析 候选基因
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513
【目录】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-43
• 1.1 AM真菌的简介15-16
• 1.2 AM真菌的分类16-17
• 1.3 AM真菌的培养方法17-20
• 1.3.1 盆栽培养法18
• 1.3.2 培养基培养法18
• 1.3.3 营养液培养法18
• 1.3.4 雾化培养法18
• 1.3.5 玻璃珠分室培养法18-19
• 1.3.6 大田培养法19
• 1.3.7 AM真菌与普通根双重培养19
• 1.3.8 AM真菌与Ri-T-DNA转型根的双重单胞无菌培养法19
• 1.3.9 AM真菌与Ri-T-DNA转型根双重培养的改良分室单孢培养系统19-20
• 1.4 AM真菌的结构20-22
• 1.5 AM共生过程22-27
• 1.5.1 信号分子22-23
• 1.5.2 共生过程23-25
• 1.5.3 菌根诱导的抗性25
• 1.5.4 丛枝的发育25-26
• 1.5.5 参与AM共生的植物基因的简介26-27
• 1.6 AM真菌与寄主植物间的相互作用27-36
• 1.6.1 AM真菌对植物糖转运的影响27-28
• 1.6.2 AM真菌对植物生长、产量和品质的影响28-29
• 1.6.3 AM真菌增强植物对矿质元素的吸收29-31
• 1.6.4 AM真菌可提高植物的抗逆性31-33
• 1.6.5 AM真菌可提高植物的抗病性33-34
• 1.6.6 AM真菌与其他微生物的关系34-35
• 1.6.7 AM真菌可提高植物的抗重金属能力35-36
• 1.7 植物激素与AM真菌的共生36-37
• 1.8 生态因素对AM真菌的影响37-38
• 1.8.1 土壤水份对AM真菌的影响37
• 1.8.2 土壤pH对AM真菌的影响37-38
• 1.8.3 土壤肥力对AM真菌的影响38
• 1.8.4 光照条件对AM真菌的影响38
• 1.8.5 温度对AM真菌的影响38
• 1.8.6 农业生产活动对AM真菌的影响38
• 1.9 植物入侵对AM真菌的影响38-39
• 1.10 菌根的自我调控作用39-40
• 1.11 全基因组关联分析40-41
• 1.12 本研究的目的和意义41-43
• 2 材料与方法43-52
• 2.1 供试植物材料43-45
• 2.2 菌株和载体45-46
• 2.3 盆栽种植46
• 2.3.1 番茄的盆栽种植46
• 2.3.2 玉米的盆栽种植46
• 2.4 大田试验46
• 2.5 台盼蓝染色46-47
• 2.6 AM真菌对植物根系侵染率的测定47
• 2.7 玉米纹枯病菌接种和病情分析47
• 2.8 全基因组关联分析47
• 2.9 RNA的操作47
• 2.10 玉米突变体的鉴定47-48
• 2.11 水稻突变体的鉴定48
• 2.12 同源基因cDNA的获得及表达载体的构建48-50
• 2.13 农杆菌介导的烟草和番茄的遗传转化50-51
• 2.13.1 烟草遗传转化程序50
• 2.13.2 番茄遗传转化程序50-51
• 2.14 转基因烟草植株的阳性鉴定51
• 2.15 无机磷含量的测定51-52
• 3 结果与分析52-75
• 3.1 AM和AMF孢子的培养52
• 3.2 AM真菌对五种番茄的促生作用52-55
• 3.2.1 番茄与AM真菌的共生情况52-53
• 3.2.2 AM真菌对不同番茄品种农艺性状的影响53-55
• 3.3 AM真菌与玉米B73共生体系的建立55-56
• 3.3.1 玉米B73菌根的形态55
• 3.3.2 AM真菌对B73生长和纹枯病发生情况的影响55-56
• 3.4 AM真菌对商品化玉米品种的影响56-59
• 3.4.1 盆栽试验中AM真菌对商品化玉米品种生长的影响56-58
• 3.4.2 田间试验中AM真菌对商品化玉米品种的影响58-59
• 3.5 AMF与380份玉米自交系共生效率的调查59-63
• 3.6 全基因组关联分析63-65
• 3.6.1 全基因组关联分析的结果63-65
• 3.6.2 候选基因功能预测65
• 3.7 玉米中基因MSERG 4的功能研究65-69
• 3.7.1 玉米突变体的鉴定65-66
• 3.7.2 玉米突变体AM真菌侵染率测定66-68
• 3.7.3 玉米突变体中无机磷含量的测定68-69
• 3.8 不同物种中MSERG 4同源基因的功能测试69-75
• 3.8.1 水稻中MSERG 4同源基因的功能研究69-70
• 3.8.2 烟草、番茄中MSERG 4同源基因功能研究70-75
• 3.8.2.1 同源基因cDNA的获得和表达载体的构建70-73
• 3.8.2.2 农杆菌介导的遗传转化73-75
• 4 讨论75-78
• 4.1 AM真菌对番茄和玉米B73生长和抗病性的影响75
• 4.2 玉米自交系AM真菌根系侵染率呈现多样性75-76
• 4.3 AM真菌对先玉335和郑单958玉米的促生效果不显著76
• 4.4 基因MSERG 4在AM真菌与玉米共生过程中的作用76-77
• 4.5 不同物种间基因MSERG 4同源基因的功能研究77-78
• 5 结论78-79
• 5.1 AM真菌对番茄和玉米B73生长存在促进作用78
• 5.2 玉米自交系根系侵染率呈现多样性78
• 5.3 基因MSERG 4参与调控AM真菌与玉米的共生过程78-79
• 参考文献79-101
• 致谢101-102
• 附录102
• 附录1：部分实验的详细操作程序102-104
• Protocol 1：植物总DNA小样抽提法102
• Protocol 2：植物总RNA的提取102
• Protocol:3: Reverse Transcription for RT-PCR and quantitative RT-PCR102-103
• Protocol 4：热激转化大肠杆菌(DH5α)103
• Protocol 5：重组载体电转化农杆菌感受态细胞103-104
• 附录2：攻读学位期间发表论文情况104

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