奶牛乳腺上皮FcRn促进Fc与S.aureus黏附素融合蛋白胞吞转运及本动物免疫效果的研究

发布时间：2024-05-11 23:03

　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)引起的奶牛乳腺炎目前尚无有效的商品化疫苗,而有研究发现相比S.aureus纤维连接素结合蛋白 B(fibronectin binding protein B,FnBPB)和凝集因子 A(clumping factor A,ClfA)两种黏附素的重组蛋白FnBPB-ClfA,其IgG Fc段融合重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA刺激机体产生了更高水平的全身及乳腺局部体液免疫应答。因此,本研究对S.aureus黏附素重组蛋白与牛Fc融合后是否通过FcRn的参与提高抗原蛋白转运效率进行了研究,随后使用该融合重组蛋白为抗原的亚单位疫苗进行本动物的免疫效果评估,并研发一种比传统方法使用简便、省时省力的、可在奶牛接种疫苗前后进行免疫效果细菌学评价的鉴别显色培养基。1.S.aureus基因工程亚单位疫苗抗原蛋白转运效率的探究:将原代奶牛乳腺上皮细胞(primary bovine mammary epithelial cells,pbMECs)培养于Transwell至形成完整性较好的细胞屏障。此时细胞屏障上方加入重组蛋白及...

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 奶牛乳腺炎分类
    1.2 奶牛乳腺炎的病原菌分类
        1.2.1 环境性病原菌
        1.2.2 传染性病原菌
    1.3 奶牛乳腺炎的流行病学
        1.3.1 病原菌
        1.3.2 宿主
        1.3.3 传播媒介
    1.4 奶牛乳腺炎的影响
        1.4.1 社会影响
        1.4.2 经济损失
        1.4.3 耐药菌的传播
    1.5 奶牛乳腺炎的防控
        1.5.1 外源性病原菌的防控
        1.5.2 卧床、垫料中病原菌的防控
        1.5.3 泌乳期病原菌的防控
        1.5.4 干乳期病原菌的防控
        1.5.5 其他饲养管理的加强
    1.6 奶牛乳腺炎的检测方法
        1.6.1 病原菌分离培养、生化鉴定法
        1.6.2 鉴别培养基法
        1.6.3 MALDI-TOF法
        1.6.4 PCR法
        1.6.5 16S rRNA测序法
        1.6.6 其他基于基因型的鉴定方法
    1.7 奶牛乳腺炎的治疗
        1.7.1 抗生素疗法
        1.7.2 辅助治疗
        1.7.3 加强合理治疗的认识
    1.8 奶牛乳腺炎疫苗的研究进展
        1.8.1 大肠杆菌疫苗
        1.8.2 乳房链球菌疫苗
        1.8.3 S.aureus疫苗
    1.9 研究的目的与意义
2 研究一 S.aureus疫苗抗原蛋白跨乳腺上皮屏障转运效率的探究
    2.1 试验材料
        2.1.1 细胞及培养液
        2.1.2 主要试剂和材料
        2.1.3 仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 重组蛋白的制备
        2.2.2 pbMECs体外胞吞转运实验
    2.3 结果
        2.3.1 重组蛋白的制备
        2.3.2 pbMECs的培养
        2.3.3 pbMECs屏障完整性的检测结果
        2.3.4 pbMECs参与重组蛋白胞吞转运
        2.3.5 重组蛋白在pbMECs胞内的转运路径
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 研究二 奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定
    3.1 试验材料
        3.1.1 牛群
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 牛奶样品的采集
        3.2.2 病原菌的分离及初步鉴定
        3.2.3 病原菌的分子生物学鉴定
    3.3 结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 研究三 奶牛乳腺炎病原菌鉴别显色培养基的研制
    4.1 试验材料
        4.1.1 菌种
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 仪器设备
    4.2 试验方法
        4.2.1 奶牛乳腺炎病原菌的分组鉴别
        4.2.2 各组病原菌特异性酶的筛选
        4.2.3 酶的保守性、特异性的验证
        4.2.4 酶显色底物的合成
        4.2.5 病原菌发酵产酸的碳源的筛选
        4.2.6 基础培养基的选择
        4.2.7 含有显色底物和/或碳源的培养基显色效果的评估
        4.2.8 鉴别显色培养基成分的优化
    4.3 结果
        4.3.1 奶牛乳腺炎病原菌鉴别的分组结果
        4.3.2 特异性酶的筛选结果
        4.3.3 酶特异性的验证结果
        4.3.4 酶显色底物的合成
        4.3.5 病原菌可发酵产酸的碳源
        4.3.6 含有显色底物、碳源的培养基的显色效果
        4.3.7 鉴别显色培养基成分的优化
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 研究四 鉴别显色培养基法分离鉴定奶牛乳腺炎病原菌的评估
    5.1 试验材料
        5.1.1 牛群
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 仪器设备
    5.2 试验方法
        5.2.1 牛奶样品的采集
        5.2.2 培养基的制备
        5.2.3 鉴别显色培养基分离鉴定病原菌
        5.2.4 传统的培养基辅以生化方法分离鉴定病原菌
        5.2.5 16S rRNA核酸序列测定鉴定病原菌
        5.2.6 数据统计分析
    5.3 结果
        5.3.1 乳腺炎牛奶样品中病原菌在鉴别显色培养基上的菌落形态
        5.3.2 鉴别显色培养基与传统分离培养及生化鉴定的一致性检验
        5.3.3 鉴别显色培养基与16S rRNA测序鉴定的一致性检验
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 研究五 S.aureus亚单位疫苗本动物免疫试验及免疫效果评估
    6.1 试验材料
        6.1.1 试验动物
        6.1.2 主要试剂和材料
        6.1.3 仪器设备
    6.2 试验方法
        6.2.1 试验动物的筛选与分组
        6.2.2 重组蛋白及疫苗的制备
        6.2.3 鉴别显色培养基的制备
        6.2.4 免疫程序及样品采集
        6.2.5 指标检测
    6.3 试验结果
        6.3.1 S.aureus亚单位疫苗本动物免疫效果增强验证试验
        6.3.2 S.aureus亚单位疫苗免疫效果评估试验结果
    6.4 讨论
    6.5 小结
7 全文结论
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3970502