长白山森林土壤纤维素酶基因多样性分析及基因克隆与表达

发布时间：2017-06-05 18:26

  本文关键词：长白山森林土壤纤维素酶基因多样性分析及基因克隆与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：寻找清洁可再生的石油替代能源是21世纪一个重要的研究发展方向。纤维素的微生物降解转化是生产清洁可再生生物燃料的理想手段。筛选新的具有优良性质的纤维素酶具有重要的生态学意义和生产应用价值。天然环境,尤其是微生物资源最丰富的土壤环境是筛选纤维素酶基因的重要来源,保存完好的长白山自然保护区是一个理想的土样样品采集地。利用同源扩增、TAIL-PCR等分子手段,我们对长白山森林土壤纤维素酶基因的多样性进行了研究,从中成功的筛选到了新的纤维素酶基因,并完成了异源表达和酶学性质检测,为纤维素酶结构与功能的研究提供了实验数据,为人们更好的改造和利用纤维素酶提供了必要的理论依据。本文取得具体实验结果如下:1.构建了长白山森林土壤GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因文库,并对这两个文库的基因多样性进行了研究。利用两对简并引物分别构建了长白山森林土壤GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因文库,并通过大量测序及系统发育分析获得了这两个家族的基因多样性情况。结果表明GH7_cbhI家族文库基因多样性较高,序列相似度在99-38%之间,95%的基因序列与来自子囊菌门和担子菌门的非培养微生物基因序列相似度最高。GH48家族文库基因序列呈现“单极化”现象,即80%以上的序列都很保守,与来自Herpetosiphon aurantiacus的内切纤维素酶序列相似度最高。将这两个长白山土壤基因文库与其他报道的基因文库进行比较发现,长白山土壤文库基因多样性情况与玉米秸秆文库相似,与海洋沉积物文库存在差异。丰富的基因多样性也证明了长白山森林土壤是纤维素酶开发的理想资源库。2.利用同源扩增和TAIL-PCR等方法获得了多条GH48和GH5家族纤维素酶基因序列,并对其序列结构进行了分析。共克隆到2个GH48家族内切纤维素酶基因,6个GH5家族内切纤维素酶基因。利用同源扩增和TAIL-PCR方法,首次从天然土壤环境中克隆得到了GH48家族纤维素酶基因cel48_hm01。该基因与Herpetosiphon aurantiacus的内切纤维素酶[WP_012187855.1]相似度最高,达62%。cel48_hm01基因蛋白序列包括一个CBM_2结合结构域和一个GH48催化结构域;同时克隆了单结构域基因cel48_hm02,其序列中仅含有一个GH48催化结构域。利用同源引物直接扩增的方法,从土壤样品基因组DNA中扩增得到了6个GH5家族内切纤维素酶基因:egl01、egl02、egl03、egl04、egl05、egl06。egl01基因较egl02基因在N端缺少了17个氨基酸的序列,但两者序列中均包含了N端催化结构域GH5和C端结合结构域CBM_3;两者均与Bacillus licheniformis的内切纤维素酶序列相似度最高,分别达99%和100%。egl03、egl04、egl05和egl06四个基因与egl02基因存在一些氨基酸位点上的差异,与bacilluslicheniformis的内切纤维素酶序列相似度均为99%。这些基因的获得,为研究gh5家族纤维素酶蛋白结构与功能的关系提供了理想的天然突变体。3.首次表达和纯化了从土壤环境样品中直接克隆得到的gh48家族纤维素酶,并对重组酶进行了酶学性质检测和同源模建。本文首次对土壤样品直接克隆得到的gh48家族内切纤维素酶基因进行了原核表达和纯化。酶学性质检测发现重组酶cel48_hm01/cel48_hm02具有一定的嗜酸性和热稳定性,最适反应ph和最适反应温度分别为6.0,50℃;在ph8.0-10.0范围内及70℃下处理3h均能保持50%以上酶活。一定浓度的na+,k+,ca2+,fe3+等金属离子能够显著促进酶活,此外重组酶还具有较好的底物特异性。同源建模结果显示,重组酶cel48_hm01/cel48_hm02与clostridiumcellulolyticum的内切纤维素酶celf(pdb:1fbw)高级结构同源性在58%以上,且重组酶的gh48家族主要催化残基与模板一致。这表明重组酶可能也采用了梭菌属gh48纤维素酶的催化机制。以上研究结果为探讨gh48家族蛋白结构与功能的关系提供了实验数据支持。4.对gh5家族纤维素酶egl01进行了原核表达和性质检测,对其序列删减突变体的部分酶学性质进行了测定,并对egl01活性相关的关键氨基酸位点进行了定点突变研究。酶学性质检测结果表明,ph5.0,50℃条件下egl01活性最高,ph3.0-9.0,4-50℃条件下活性稳定。在金属离子,有机试剂,表面活性剂和高浓度盐离子等存在的条件下,egl01活性仍十分稳定。3mkcl和2mnacl分别使其酶活增加到135%和139%。此外,1-4mkcl/nacl6d条件下酶活仍保持在70%以上。egl01还具有较好的底物特异性,能水解羧甲基纤维素、榉木木聚糖、海带多糖、滤纸和结晶纤维素,表明其具有广泛的工业应用潜力。在对egl01序列进行分析的基础上,对其c端可能和嗜酸性相关的短肽以及和底物结合有关的cbm结构域进行了删减突变,结果显示“ngkliwgtepk”短肽删除后,突变体的嗜酸性与egl01相比并未发生明显改变,表明该短肽并非酶嗜酸性的直接结构基础。而cbm删减突变体在底物特异性上发生了显著变化,丧失了对不溶性底物的降解能力,证明cbm结构域的完整性对于egl01酶活具有的重要意义。对同源扩增获得的egl01天然突变体进行了表达和功能分析,发现其基本性质未发生明显改变,说明这些突变位点不是gh5家族纤维素酶活性的关键位点。通过与现有gh5家族纤维素酶的比对,确定了5个位于纤维素酶“凹槽”结构中可能与底物结合相关的关键氨基酸位点,定点突变的结果显示这些位点对酶活性具有重要作用,单个位点的变化即可造成酶活性的显著降低甚至丧失,这些结果为酶的改造及作用机制的研究提供了信息。
【关键词】：纤维素酶 长白山森林土壤 基因多样性 同源扩增 表达 性质检测
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S714
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文缩写词表9-13
• 第一章 前言13-45
• 1.1 生物质与生物质能源13-17
• 1.1.1 生物质与生物质能源的涵义13-14
• 1.1.2 生物质能源的开发14-15
• 1.1.3 生物质能源的工业生产15-17
• 1.2 纤维素的研究进展17-22
• 1.2.1 天然纤维素的来源17-19
• 1.2.2 纤维素的结构19-21
• 1.2.3 纤维素的微生物降解21-22
• 1.3 纤维素酶的研究进展22-40
• 1.3.1 纤维素酶的组成和结构22-24
• 1.3.2 纤维素酶的家族划分24-28
• 1.3.3 纤维素酶的作用机制28-31
• 1.3.4 纤维素酶的分子研究31-33
• 1.3.5 宏基因组学技术在纤维素酶基因克隆中的应用33-40
• 1.4 土壤微生物资源和长白山自然保护区微生物资源研究概况40-43
• 1.4.1 土壤微生物资源40-41
• 1.4.2 土壤微生物研究进展41-42
• 1.4.3 长白山自然保护区概况42
• 1.4.4 长白山森林土壤微生物资源研究概况42-43
• 1.5 立题依据及研究内容43-45
• 1.5.1 立题依据43
• 1.5.2 研究内容43-45
• 第二章 长白山森林土壤环境纤维素酶基因多样性研究45-76
• 2.1 实验材料45-47
• 2.1.1 样品采集和处理45
• 2.1.2 试剂盒及药品45-46
• 2.1.3 培养基与试剂配制46-47
• 2.1.4 仪器设备47
• 2.1.5 所用引物47
• 2.1.6 引物合成及质粒测序47
• 2.2 实验方法47-50
• 2.2.1 土壤微生物宏基因组DNA的提取和纯化47-48
• 2.2.2 土壤纤维素酶活力检测48
• 2.2.3 GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因片段扩增及文库构建48-49
• 2.2.4 GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因多样性及系统发育分析49-50
• 2.3 实验结果50-71
• 2.3.1 长白山土壤样品的理化性质测定50-51
• 2.3.2 土壤微生物宏基因组DNA的提取和纯化51-52
• 2.3.3 GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因片段的扩增及文库构建52-54
• 2.3.4 GH7_cbhI和GH48家族纤维素酶基因多样性及系统发育分析54-71
• 2.4 讨论71-74
• 2.5 本章小结74-76
• 第三章 长白山森林土壤纤维素酶基因克隆和序列分析76-96
• 3.1 实验材料76-77
• 3.1.1 模板DNA76
• 3.1.2 实验菌株,载体,工具酶以及试剂76
• 3.1.3 引物合成及DNA测序76-77
• 3.2 实验方法77-81
• 3.2.1 GH48家族纤维素酶基因的克隆77-80
• 3.2.2 GH5家族纤维素酶基因的克隆80-81
• 3.2.3 克隆基因的转化和测序81
• 3.2.4 克隆基因的序列分析81
• 3.3 实验结果81-92
• 3.3.1 GH48家族纤维素酶基因的克隆和序列分析81-88
• 3.3.2 纤维素酶基因egl01的克隆和序列分析88-92
• 3.4 讨论92-94
• 3.5 本章小结94-96
• 第四章 新的GH48家族纤维素酶基因的表达及性质研究96-120
• 4.1 实验材料96-98
• 4.1.1 实验菌株和质粒96
• 4.1.2 培养基、试剂盒和工具酶96
• 4.1.3 溶液配制和药品96-98
• 4.1.4 仪器设备98
• 4.1.5 质粒DNA测序98
• 4.2 实验方法98-103
• 4.2.1 重组质粒的构建98-99
• 4.2.2 重组蛋白的原核表达和电泳检测99-101
• 4.2.3 重组蛋白的纯化及复性101
• 4.2.4 重组蛋白的蛋白浓度测定101-102
• 4.2.5 重组蛋白的纤维素酶活测定102
• 4.2.6 重组蛋白的酶学性质测定102-103
• 4.2.7 重组蛋白的同源模建103
• 4.3 实验结果103-118
• 4.3.1 重组酶的原核表达与纯化103-107
• 4.3.2 重组酶的酶学性质研究107-114
• 4.3.3 重组酶的同源模建114-118
• 4.4 讨论118-119
• 4.5 本章小结119-120
• 第五章 GH5家族纤维素酶基因的表达及性质研究120-146
• 5.1 实验材料120-121
• 5.1.1 实验菌株和质粒120-121
• 5.1.2 培养基和缓冲液121
• 5.1.3 试剂和工具酶121
• 5.1.4 仪器设备121
• 5.1.5 质粒DNA测序121
• 5.2 实验方法121-125
• 5.2.1 重组质粒的构建121
• 5.2.2 重组蛋白的原核表达121-122
• 5.2.3 重组蛋白的纯化122
• 5.2.4 重组蛋白的蛋白浓度测定122
• 5.2.5 重组蛋白的纤维素酶活测定122
• 5.2.6 重组蛋白的酶学性质测定122-123
• 5.2.7 重组酶Egl01序列删减突变体的构建123
• 5.2.8 重组酶Egl01关键氨基酸的定点突变123-125
• 5.3 实验结果125-142
• 5.3.1 重组酶的原核表达与纯化125-127
• 5.3.2 重组酶的酶学性质研究127-133
• 5.3.3 重组酶Egl01突变体的酶学性质133-136
• 5.3.4 重组酶Egl01的定点突变136-142
• 5.4 讨论142-144
• 5.5 本章小结144-146
• 全文总结146-148
• 参考文献148-168
• 致谢168-170
• 在学期间公开发表论文及著作情况170

【参考文献】

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