VDR在绵羊睾丸、附睾内的表达及维生素D对绵羊附睾细胞的影响

发布时间：2017-06-09 20:11

  本文关键词：VDR在绵羊睾丸、附睾内的表达及维生素D对绵羊附睾细胞的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]维生素D是一种类固醇激素,1α,25-(OH)2D3是其在动物体内的活性形式,并在动物健康方面发挥重要作用。维生素D在维生素D受体(VDR)的帮助下发挥生理功能,例如钙平衡、骨代谢、细胞增殖与分化,但是维生素D对附睾的影响尚不清楚。本研究目的在于探究VDR在睾丸、附睾内的表达情况,以及维生素D是否会对附睾细胞的活力、增殖、凋亡、抗氧化以及分泌功能有影响。[方法]本研究采用PCR、免疫组化、Real-time PCR、Western blotting等技术手段,检测VDR在绵羊附睾头、体、尾以及睾丸中的表达情况；通过对体外培养的附睾头、体、尾细胞进行不同浓度的1α,25-(OH)2D3(0 nM,1nM,10nM,100 nM)刺激,采用细胞计数、Real-time PCR、酶联免疫反应等技术,检测1α,25-(OH)2D3对附睾头、体、尾细胞活力和增殖,凋亡相关基因p53、bax、bcl-2表达,总抗氧化能力、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力、谷胱甘肽S-转移酶活力,唾液酸、α-1,4糖苷酶及乳铁蛋白三种附睾分泌蛋白的影响。[结果](1)VDR蛋白存在于绵羊附睾头、体、尾的上皮细胞,睾丸间质细胞、精原干细胞、精母细胞以及支持细胞中；绵羊附睾头、体、尾内VDR mRNA与VDR蛋白含量皆显著高于睾丸；(2)对体外培养的附睾头、体、尾细胞进行不同浓度的1α,25-(OH)2D3(0 nM,1 nM, 10 nM,100 nM)刺激后,细胞活力显著增强(P0.05/P0.01)；细胞增殖显著(P0.05/P0.01)；对凋亡相关基因p53、6ax、bcl-2的mRNA表达均无显著影响；对细胞的总抗氧化能力、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力、谷胱甘肽S-转移酶活力具有显著的促进作用(P0.05/P0.01)；细胞分泌的唾液酸、乳铁蛋白明显增加(P0.05/P0.01),但对a-1,4糖苷酶的分泌没有显著影响。[结论]VDR在绵羊睾丸、附睾中表达,1α,25-(OH)2D3能够改善附睾细胞的某些功能,预示着1α,25-(OH)2D3可能通过间接作用改善精液品质。
【关键词】：绵羊 附睾 细胞 1α 25-(OH)_2D_3 VDR
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要8-9
• 前言9-10
• 第一章 文献综述10-27
• 1 维生素D研究概况10-12
• 1.1 维生素D研究历史10
• 1.2 维生素D的代谢10
• 1.3 维生素D需要量10-11
• 1.4 维生素D受体11-12
• 1.5 维生素D应答元件(VDRE)12
• 2 维生素D与生殖12-17
• 2.1 VDR在雄性生殖器官内的表达12-15
• 2.2 VDR与维生素D代谢相关基因与雄性动物生殖的关系15-16
• 2.3 维生素D缺乏与生殖能力16-17
• 3 维生素D代谢的调节及下游调节因子的推测17-18
• 4 课题的提出及意义18-20
• 参考文献20-27
• 第二章 VDR mRNA及VDR蛋白在睾丸、附睾内的表达27-52
• 1 材料与方法27-34
• 1.1 试验材料27-28
• 1.1.1 主要试剂27-28
• 1.1.2 主要仪器28
• 1.2 试验方法28-34
• 1.2.1 样品采集28-29
• 1.2.2 引物设计29
• 1.2.3 总RNA的提取29-30
• 1.2.4 总RNA内基因组DNA的去除及cDNA合成30
• 1.2.5 PCR30
• 1.2.6 胶回收30-31
• 1.2.7 连接转化测序31
• 1.2.8 序列比对31
• 1.2.9 石蜡切片制作31-32
• 1.2.10 免疫组化32-33
• 1.2.12 标曲制作33
• 1.2.13 Western-blotting33
• 1.2.14 数据处理与统计方法33-34
• 2 试验结果34-48
• 2.1 VDR mRNA在附睾头、体、尾、睾丸内的表达34
• 2.2 VDR mRNA测序结果34-35
• 2.3 VDR mRNA序列比对结果35-39
• 2.4 VDR蛋白在绵羊睾丸内的定位39-40
• 2.5 VDR蛋白在绵羊附睾头内的定位40-41
• 2.6 VDR蛋白在绵羊附睾体内的定位41-42
• 2.7 VDR蛋白在绵羊附睾尾内的定位42-43
• 2.8 附睾头、体、尾、睾丸内VDR mRNA表达差异43-44
• 2.8.1 目的基因与内参基因的溶解曲线43
• 2.8.2 目的基因与内参基因的标准曲线43
• 2.8.3 附睾头、体、尾、睾丸内VDR mRNA表达差异43-44
• 2.9 性成熟前后附睾头、体、尾、睾丸内VDR mRNA表达差异44-45
• 2.10 附睾头、体、尾、睾丸内VDR蛋白表达差异45-46
• 2.11 性成熟前后附睾头、体、尾、睾丸内VDR蛋白表达差异46-48
• 3 讨论48-50
• 参考文献50-52
• 第三章 维生素D对附睾细胞活力、增殖及凋亡的影响52-64
• 1 材料与方法52-54
• 1.1 试验材料52
• 1.1.1 主要试剂52
• 1.1.2 主要仪器52
• 1.2 试验方法52-54
• 1.2.1 附睾头、体、尾细胞的分离52-53
• 1.2.2 附睾头、体、尾细胞的原代及传代培养53
• 1.2.3 细胞活力检测53
• 1.2.4 细胞增殖检测53
• 1.2.5 附睾细胞Real-time PCR样品制备53
• 1.2.6 引物设计53-54
• 1.2.7 荧光定量PCR54
• 1.2.8 数据处理及统计分析54
• 2 结果54-61
• 2.1 附睾头、体、尾细胞形态观察54-56
• 2.2 1α,25-(OH)_2D_3对附睾细胞活力的影响56-57
• 2.3 1α,25-(OH)_2D_3对附睾细胞增殖的影响57-58
• 2.4 1α,25-(OH)_2D_3对附睾细胞p53,bax,bcl-2基因表达的影响58-61
• 2.4.1 目的基因与内参基因的溶解曲线58-59
• 2.4.2 目的基因与内参基因的标准曲线59-60
• 2.4.3 1α,25-(OH)_2D_3对附睾细胞p53,bax,bcl-2基因表达的影响60-61
• 3 讨论61-63
• 参考文献63-64
• 第四章 维生素D对附睾细胞抗氧化能力的影响64-80
• 1 材料与方法64-70
• 1.1 试验材料64-65
• 1.1.1 主要试剂64
• 1.1.2 主要仪器64-65
• 1.2 试验方法65-70
• 1.2.1 样品制备65
• 1.2.2 总抗氧化能力检测65-66
• 1.2.3 过氧化氢酶活力检测66-67
• 1.2.4 超氧化物歧化酶活力测定67
• 1.2.5 谷胱甘肽过氧化物酶测定67-69
• 1.2.6 谷胱甘肽S-转移酶测定69-70
• 1.2.7 数据处理及统计分析70
• 2 结果70-76
• 2.1 1α,25-(OH)_2D_3对附睾T-AOC的影响70-71
• 2.2 1α,25-(OH)_2D_3对附睾CAT活力的影响71-72
• 2.3 1α,25-(OH)_2D_3对附睾头SOD活力的影响72-73
• 2.4 1α,25-(OH)_2D_3对附睾GSH-PX活力的影响73-75
• 2.5 1α,25-(OH)_2D_3对附睾GST活力的影响75-76
• 3 讨论76-78
• 参考文献78-80
• 第五章 维生素D对附睾细胞分泌功能的影响80-90
• 1 材料与方法80-82
• 1.1 试验材料80-81
• 1.1.1 主要试剂80
• 1.1.2 主要仪器80-81
• 1.2 试验方法81-82
• 1.2.1 细胞培养81
• 1.2.2 细胞上清内唾液酸的测定81
• 1.2.3 绵羊α-1,4糖苷酶的测定81-82
• 1.2.4 绵羊乳铁蛋白的测定82
• 1.2.5 数据处理及统计分析82
• 2 结果82-87
• 2.1 1α,25-(OH)_2D_3对附睾SA分泌的影响82-83
• 2.2 1α,25-(OH)_2D_3对附睾头细胞分泌α-1,4糖苷酶的影响83-85
• 2.3 1α,25-(OH)_2D_3对附睾头乳铁蛋白分泌的影响85-87
• 3 讨论87-89
• 参考文献89-90
• 全文结论90-91
• 论文存在的不足和后期研究设想91-92
• 中英文对照表92-94
• Abstract94-96
• 致谢96

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