转录分析烟粉虱应对寄主转换的分子机制及唾液效应因子BtQ56在其中的作用

发布时间：2017-06-24 03:03

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【摘要】：烟粉虱Bemisia tabaci是一个物种复合体,至少包含34个外部形态难以区分但相互之间存在生殖隔离的隐种。其中,Middle East Asia Minor1(MEAM1)和Mediterranean (MED)烟粉虱是世界范围的入侵害虫,己入侵到包括中国在内的许多国家和地区并逐渐取代许多土著烟粉虱,对农业生产造成巨大危害。本实验室之前的研究发现,入侵烟粉虱MEAM1比土著烟粉虱Asia Ⅱ3具有更广泛的寄主范围,这可能是其能够入侵和取代土著烟粉虱的重要原因之一。在自然环境中,烟粉虱的扩散和繁衍需要应对和利用不同的寄主植物,因此明确不同隐种烟粉虱在寄主适应能力上的差异及寄主适应性的分子机制,对深入了解烟粉虱的入侵机制和烟粉虱-植物互作的复杂关系有着重要的意义。 本论文首先比较了入侵烟粉虱MEAM1和土著烟粉虱Asia Ⅱ3从其适宜寄主棉花上转移到不适寄主烟草上后死亡率和产卵量的差异。然后通过数字基因表达谱技术分析了寄主转换后,两个隐种烟粉虱在基因转录水平上的差异。最后结合烟粉虱唾液腺转录组,筛选与烟粉虱寄主适应性相关的唾液效应因子蛋白并研究其功能。研究结果如下： (1) MEAM1烟粉虱具有更强的适应寄主转换的能力 当MEAM1和Asia Ⅱ3烟粉虱从棉花上转移到烟草上24h后,其死亡率和繁殖力都发生显著变化,但MEAM1的死亡率显著低于AsiaⅡ3烟粉虱,而MEAM1的单头产卵量则要显著高于Asia Ⅱ3,这说明与Asia Ⅱ3烟粉虱相比MEAM1烟粉虱具有更强的适应非适宜寄主的能力。 (2)寄主转移后NIE AM1和Asia Ⅱ3烟粉虱的基因转录差异 通过数字基因表达谱分析了NIE AMI和Asia Ⅱ3烟粉虱寄主转换前后的基因表达的不同,发现两个隐种烟粉虱的基因转录存在巨大差异,MEAM1烟粉虱的差异表达基因数量远小与AsiaⅡ3。AsiaⅡ3烟粉虱的差异表达基因的变化倍数更大且以下调为主,而MEAM1的差异表达基因的变化倍数较小且多为上调。寄主转换后,Asia Ⅱ3烟粉虱的碳水化合物及能量代谢途径受到了显著的抑制,而MEAM1烟粉虱则受影响不大。此外,MEAM1烟粉虱的基因表达和蛋白代谢途径在寄主转换后被激活。相对于解毒酶基因在MEA M1烟粉虱中的持续高表达,绝大多数的解毒酶基因在Asia Ⅱ3中下调。P450、GST和酯酶的酶活力测定进一步证明了MEAM1烟粉虱的解毒代谢能力比AsiaⅡ3烟粉虱强。 (3)唾液蛋白BtQ56在寄主转换中的作用 结合表达谱和唾液腺转录组信息,我们筛选了68个可能与寄主适应性相关的疑似唾液蛋白基因,通过RNAi和植物瞬时表达等方法发现一个唾液蛋白BtQ56具有促进烟粉虱存活和产卵的功能。BtQ56基因是一个在烟粉虱唾液腺中特异性高表达的功能未知基因,氨基酸序列含有信号肽且不含跨膜区,具有典型的分泌蛋白结构,且未在GeneBank中检索到任何同源基因或保守的功能结构域。BtQ56基因在入侵烟粉虱MEAM1和MED中的表达量远远高于土著Asia Ⅱ3烟粉虱。在寄主转换后BtQ56基因在NE AMI和MED烟粉虱中显著上调,而Asia Ⅱ3烟粉虱中变化不大,这表明大量的BtQ56可能在寄主转换过程中发挥着重要作用。通过Western blot的方法,我们在烟粉虱取食过的植物中检测到了BtQ56蛋白,从而证明BtQ56是一个烟粉虱唾液分泌蛋白。为进一步明确BtQ56是如何增强烟粉虱寄主适应性的,我们分析了BtQ56作用于植物后对植物防御反应相关基因转录的影响,发现BtQ56可能诱导SA途径并抑制JA途径及植物蛋白酶抑制剂基因的转录,以此达到抑制植物抗性促进烟粉虱存活的目的。 综上所述,在烟粉虱应对非适宜寄主的过程中,入侵烟粉虱与土著隐种烟粉虱之间在适应能力上存在明显差异。从棉花转移到烟草后,碳水化合物及能量代谢和解毒代谢在Asia Ⅱ3烟粉虱中受到显著的抑制,而在MEAM1中变化不大,说明MEAM1在这些方面具有较强的耐受能力。基因表达和蛋白代谢途径在MEAM1烟粉虱中的激活可能是MEAM1具有较强寄主转换适应能力的重要原因。除此之外,唾液效应蛋白BtQ56在烟粉虱应对烟草防御反应的过程中发挥着重要的作用。
【关键词】：烟粉虱 寄主转换 表达谱 唾液腺 唾液蛋白 瞬时表达 基因沉默 害虫诱导的防御反应
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433
【目录】：

• 致谢6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-15
• 1 文献综述及研究目的15-32
• 1.1 烟粉虱概述15-21
• 1.1.1 烟粉虱的生物学特性、分类和种系发生状况15-16
• 1.1.2 烟粉虱的经济重要性及危害方式16-18
• 1.1.3 烟粉虱的入侵和竞争取代的机制18-21
• 1.2 烟粉虱适应不同寄主植物的机制21-23
• 1.2.1 取食行为与营养代谢21-22
• 1.2.2 生理机制22-23
• 1.3 唾液在调控植物与昆虫互作中的作用23-30
• 1.3.1 烟粉虱的唾液腺(salivary glands)23-24
• 1.3.2 唾液的组成及作用24-28
• 1.3.3 刺吸式昆虫唾液蛋白的研究方法28-30
• 1.4 本研究目的与主要内容30-32
• 1.4.1 研究目的30-31
• 1.4.2 研究内容31-32
• 2 基本材料和方法32-41
• 2.1 基本材料32-35
• 2.1.1 供试昆虫及其实验种群维持32
• 2.1.2 供试植物32
• 2.1.3 生态学研究主要仪器和设备32-34
• 2.1.4 生化及分子生物学研究主要仪器和设备34
• 2.1.5 主要分子生物学试剂34-35
• 2.2 实验方法35-40
• 2.2.1 烟粉虱基因组DNA的提取35
• 2.2.2 烟粉虱隐种鉴定35-37
• 2.2.3 Total RNA的提取37-38
• 2.2.4 RNA反转录合成1链cDNA38
• 2.2.5 实时荧光定量PCR(qPCR)38-39
• 2.2.6 SDS-PAGE39
• 2.2.7 蛋白印迹Western blot39-40
• 2.2.8 烟粉虱临时种群的建立及初羽化雌雄虫的获得40
• 2.3 数据处理与分析40-41
• 3 不同隐种烟粉虱寄主转换的表达谱分析41-62
• 3.1 材料与方法41-45
• 3.1.1 供试昆虫与植物41
• 3.1.2 寄主转换实验41
• 3.1.3 RNA提取,DGE文库构建和Illumina测序41-42
• 3.1.4 标签注释及基因表达水平的标准化42
• 3.1.5 差异基因表达分析42-43
• 3.1.6 GO及KEGG pathway富集分析43
• 3.1.7 实时荧光定量PCR(qPCR)分析验证表达谱数据43
• 3.1.8 解毒酶活性测定43-45
• 3.2 实验结果与分析45-59
• 3.2.1 寄主转移后烟粉虱的死亡率和产卵量45-46
• 3.2.2 寄主转移后MEAM1和AsiaⅡ3烟粉虱的基因表达差异46-48
• 3.2.3 GO及KEGG pathway分析48-52
• 3.2.4 寄主转换抑制AsiaⅡ3烟粉虱的碳水化合物及能量代谢52-54
• 3.2.5 寄主转换后MEAM1烟粉虱的基因表达和蛋白质代谢变化54-55
• 3.2.6 MEAM1和AsiaⅡ3烟粉虱在解毒酶基因表达调控方面的差异55-57
• 3.2.7 MEAM1和AsiaⅡ3烟粉虱寄主转换后解毒酶活性的变化57-59
• 3.3 小结与讨论59-62
• 4 烟粉虱唾液效应因子BTQ56在寄主转换中的作用62-89
• 4.1 材料与方法62-71
• 4.1.1 供试昆虫与植物62-63
• 4.1.2 烟粉虱疑似唾液效应因子BtQ56基因的克隆和与序列分析63-64
• 4.1.3 荧光定量PCR检测BtQ56基因在各组织和发育阶段的表达64
• 4.1.4 荧光定量PCR检测BtQ56基因在寄主转换后的差异表达64
• 4.1.5 原核表达及多抗制备64-65
• 4.1.6 免疫荧光检测BtQ56在烟粉虱各组织的表达65-66
• 4.1.7 唾液分泌蛋白验证实验66
• 4.1.8 双链RNA(dsRNA)的合成66
• 4.1.9 饲喂法沉默BtQ56基因及沉默效果验证66-67
• 4.1.10 RANi后烟粉虱生物测定67
• 4.1.11 瞬时表达载体的构建及表达验证67-70
• 4.1.12 烟粉虱在瞬时表达BtQ56基因烟草上的存活率和单雌产卵量70
• 4.1.13 BtQ56基因对烟草防御基因的调控70-71
• 4.1.14 数据分析71
• 4.2 结果与分析71-85
• 4.2.1 BtQ56基因的克隆与序列分析71-74
• 4.2.2 BtQ56基因在烟粉虱在发育阶段的表达模式74-75
• 4.2.3 BtQ56基因在烟粉虱不同隐种和寄主转换后的表达差异75-76
• 4.2.4 BtQ56的原核表达和多克隆抗体制备76-77
• 4.2.5 BtQ56在烟粉虱组织中的分布77-78
• 4.2.6 Western blot验证BtQ56为烟粉虱唾液分泌蛋白78-79
• 4.2.7 饲喂dsRNA对烟粉虱BtQ56基因表达水平的影响79-80
• 4.2.8 RNAi干扰BtQ56基因对烟粉虱存活率的影响80-81
• 4.2.9 EGFP基因在烟草和棉花中的瞬时表达验证81-82
• 4.2.10 BtQ56基因在植物中瞬时表达促进烟粉虱的存活和产卵82
• 4.2.11 瞬时表达BtQ56基因对烟草防御相关基因的影响82-85
• 4.3 小结与讨论85-89
• 5 全文总结89-91
• 5.1 全文小结89-90
• 5.2 创新之处90
• 5.3 值得继续研究的问题90-91
• 参考文献91-102
• 附录102-109

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 严盈;刘万学;万方浩;;唾液成分在刺吸式昆虫与植物关系中的作用[J];昆虫学报;2008年05期

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本文编号：476918