绿盲蝽对常用杀虫药剂的抗药性监测及其抗药性机制分析

发布时间：2017-06-27 05:13

  本文关键词：绿盲蝽对常用杀虫药剂的抗药性监测及其抗药性机制分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：转Bt基因抗虫棉在我国的广泛种植导致处于次要地位的棉盲蝽猖獗跃居为棉田主要害虫并为害多种作物。在田间,防治棉盲蝽过度依赖杀虫剂不可避免的会产生抗药性问题。本文针对棉田常用杀虫剂对我国棉区冀鲁皖豫四省六个地区绿盲蝽种群的抗性水平及其解毒酶活性进行了系统监测,旨在明确绿盲蝽对常用药剂的抗性发展动态。同时对室内选育的绿盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性品系进行抗性机理的研究。这些研究结果为绿盲蝽的高效和可持续防控提供科学依据。1.绿盲蝽对六种常用杀虫剂的抗药性监测根据敏感基线确立的杀虫剂的LD99诊断计量,通过玻璃管药膜法在2013及2014年对冀鲁皖豫四省六个地区的田间绿盲蝽种群进行抗性监测。其中,2014年山东滨州绿盲蝽种群在高效氯氟氰菊酯、吡虫啉、灭多威及硫丹LD99诊断计量下的死亡率分别为45%、60%、67%与8%,表明该地区绿盲蝽种群已对上述四种杀虫剂产生一定程度的抗性。2014年河北邱县、安徽望江、安徽无为及河南西华四个田间种群在硫丹诊断剂量下死亡率为50%左右,暗示这4个种群已对硫丹产生一定程度的抗性。点滴法测定2013年及2014年冀鲁皖豫四省六地区的绿盲蝽种群的抗性水平。与室内敏感种群相比,2014年六个种群对马拉硫磷的抗性倍数较2013年略有上升；2014年安徽无为种群对毒死蜱的抗性倍数为7.8倍；2014年六个种群对硫丹的抗性倍数较2013年显著上升；2014年山东滨州种群对高效氯氟氰菊酯的抗性倍数高达29.9倍,而其他种群的抗性倍数仅为1.3-2倍之间；2014年田间种群对灭多威与2013年基本持平；2014年六个种群对吡虫啉的抗性倍数较2013年略有上升。通过动力学法比较田间种群与室内敏感品系的解毒酶活性水平差异。与室内敏感品系相比,田间种群的羧酸酯酶(CarE)及谷胱甘肽转移酶(GST)活性分布在600-800 mOD/(min-头)区段的个体频率偏高；乙酰胆碱酯酶活性分布在18mOD/(min头)区段的个体频率偏高于敏感品系,这与田间种群对杀虫剂的抗性水平有关。2.绿盲蝽钠离子通道的克隆及特征采用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增技术(RACE),将绿盲蝽钠离子通道基因进行克隆并对其可变剪接模式进行分析。最终得到全长为6858bp的绿盲蝽钠离子通道,其中开放阅读框ORF框为6087bp,共编码2028个氨基酸,命名为AlVSSC (GenBank accession number:KR139855)、523bp的5’UTR区和248bp的3’UTR区。A1VSSC蛋白具有钠离子通道蛋白所有保守结构及特征。绿盲蝽AlVSSC基因编码区包含六个可选择外显子(A、B、C、D、E、F)与一对互斥型外显子(K/L)。3.绿盲蝽抗高效氯氟氰菊酯品系与抗性相关基因的表达差异分析采用实时荧光定量PCR的方法,对室内绿盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性品系中相关的解毒代谢基因P450进行表达量的验证,结果表明CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1及CYP395H1均在抗性筛选过程中发生显著性上调(2.5-21.6倍),其中绿盲蝽的CYP6X2表达量较敏感品系上调达21.6倍；在高效氯氟氰菊酯LD20剂量下,敏感品系与抗性品系的CYP6X2 mRNA水平均能够被诱导,分别为诱导前的1.8与1.6倍。4.解毒酶P450基因(CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1、CYP395H1)的真核表达通过昆虫杆状病毒真核表达系统对可能与高效氯氟氰菊酯抗性有关的4个P450基因(CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1、CYP395H1)进行表达,并通过Western blot进行是否表达验证,最后检测ECOD活性,上述4个P450蛋白的脱乙基活性分别为115.46±5.06、95.3±7.4、61.94±10.48及148.8±8.54pmoles 7-羟基香豆素/min/mg protein,从而为蛋白代谢高效氯氟氰菊酯奠定基础。5. CYP6X2的启动子初探采用染色体步移法获得绿盲蝽CYP6X2的5’侧翼启动子序列,长度为1916 bp。运用生物信息学软件分析预测其上可能的转录因子结合位点,例如HSF、Dfd、Bcd、GATA、GCM及XRE-AhR等。构建至报告基因载体pGL-4.1basic检测不同长度启动子的荧光素梅活性,发现1820bp的启动子活性最高。6.山东滨州绿盲蝽种群对高效氯氟氰菊酯抗性机制的研究对比羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、多功能氧化酶的活性在山东滨州种群与室内敏感种群的差异,未发现显著性差异。比较两种群钠离子通道序列,发现经典点突变L1015F仅存在于山东滨州种群,该地区种群野生纯合型、杂合型、突变纯合型的频率分别为33.87、53.23与12.9%,且该基因的突变组合型处于Hardy-Weinberg (H-W)平衡。7.2014年河北沧州种群对有机磷杀虫剂的抗性采用点滴法对河北沧州种群进行毒死蜱及马拉硫磷的抗药性监测。与室内敏感品系相比,该田间种群对毒死蜱及马拉硫磷产生的抗性分别为10.7与15.5倍。通过解毒酶活性比较与靶标乙酰胆碱酯酶序列的对比,明确该田间种群对有机磷产生抗性的原因是在AlAChEl中的A216S,且在河北沧州和山东滨州种群中,突变纯合型的频率分别为100与80%。
【关键词】：绿盲蝽 抗药性监测 高效氯氟氰菊酯 钠离子通道 P450表达量 毒死蜱 A216S
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 文献综述14-32
• 1.1 绿盲蝽的简述14-16
• 1.1.1 绿盲蝽的形态特征14
• 1.1.2 绿盲蝽的生活史14-15
• 1.1.3 绿盲蝽的主要习性15
• 1.1.4 绿盲蝽的危害特点15
• 1.1.5 绿盲蝽的寄主15-16
• 1.1.6 绿盲蝽的分布区域16
• 1.2 盲蝽的抗药性现状16-19
• 1.2.1 国外盲蝽的抗药性现状16-18
• 1.2.2 国内盲蝽的抗药性现状18-19
• 1.3 盲蝽蟓对杀虫剂的抗性机理19-20
• 1.3.1 盲蝽蟓对有机磷类杀虫剂的抗性机理19-20
• 1.3.2 盲蝽蟓对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性机理20
• 1.3.3 盲蝽蟓对新烟碱类杀虫剂的抗性机理20
• 1.4 拟除虫菊酯类药剂的代谢20-30
• 1.4.1 拟除虫菊酯杀虫剂的特点20-21
• 1.4.2 拟除虫菊酯杀虫剂的靶标位点——钠离子通道21-24
• 1.4.3 昆虫对拟除虫菊酯杀虫剂的抗性研究24-30
• 1.5 本研究的目的与意义30-32
• 第二章 绿盲蝽田间种群对六种常用杀虫剂的抗药性监测32-45
• 2.1 方法与材料32-34
• 2.1.1 供试昆虫32-33
• 2.1.2 供试药剂33
• 2.1.3 抗性监测方法33-34
• 2.1.4 解毒酶活性测定34
• 2.2 结果分析34-43
• 2.2.1 诊断剂量法检测各地绿盲蝽种群的抗性个体频率34-37
• 2.2.2 利用点滴法测定六种药剂对2013年及2014年各地绿盲蝽种群的毒力37-41
• 2.2.3 田间种群的解毒酶活性水平41-43
• 2.3 小结与讨论43-45
• 第三章 绿盲蝽钠离子通道基因的克隆45-62
• 3.1 材料与方法45-54
• 3.1.1 供试昆虫45
• 3.1.2 试剂45-46
• 3.1.3 试剂的配制46
• 3.1.4 主要仪器46
• 3.1.5 引物设计46-47
• 3.1.6 总RNA的提取47-48
• 3.1.7 反转录48-49
• 3.1.8 PCR扩增、回收、连接、转化及测序分析49-53
• 3.1.9 荧光定量PCR反应53-54
• 3.1.10 序列测定及分析54
• 3.2 结果54-60
• 3.2.1 绿盲蝽钠离子通道基因的克隆54-57
• 3.2.2 绿盲蝽钠离子通道基因的选择性剪切外显子57-58
• 3.2.3 绿盲蝽钠离子通道基因的系统进化分析58-59
• 3.2.4 绿盲蝽钠离子通道基因mRNA的时空表达特征59-60
• 3.3 讨论60-62
• 第四章 高效氯氟氰菊酯选育过程中P450基因的作用62-77
• 4.1 材料与方法62-65
• 4.1.1 供试绿盲蝽及饲养方法62
• 4.1.2 试剂62
• 4.1.3 仪器62
• 4.1.4 总RNA的提取及cDNA第一条链的合成62-63
• 4.1.5 钠离子通道基因的比较63
• 4.1.6 引物的设计63-65
• 4.1.7 荧光定量PCR65
• 4.1.8 RT-PCR、3’RACE与5’RACE65
• 4.1.9 数据分析65
• 4.2 结果65-76
• 4.2.1 绿盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性选育动态变化65-66
• 4.2.2 筛选过程中钠离子通道氨基酸序列的比较66
• 4.2.3 高效氯氟氰菊酯筛选过程中P450基因的表达量66-67
• 4.2.4 LD20处理诱导CYP6X2的表达量67
• 4.2.5 高效氯氟氰菊酯筛选过程中相关P450基因的克隆67-72
• 4.2.6 相关P450基因的跨膜区及信号肽分析72
• 4.2.7 相关P450基因的系统进化分析72-74
• 4.2.8 细胞色素P450还原酶(CPR)的克隆及系统进化分析74-76
• 4.3 讨论76-77
• 第五章 P450基因的真核表达77-87
• 5.1 材料与方法78-83
• 5.1.1 供试绿盲蝽及饲养方法78
• 5.1.2 试剂78
• 5.1.3 试剂的配制78-79
• 5.1.4 仪器79
• 5.1.5 总RNA的提取及cDNA第一条链的合成79
• 5.1.6 引物的设计79
• 5.1.7 重组质粒的构建79-80
• 5.1.8 Bacmid重组质粒的提取80-81
• 5.1.9 Bacmid重组质粒转染昆虫Sf9细胞81
• 5.1.10 病毒滴度测定(空斑法)81-82
• 5.1.11 Western Blot检测82
• 5.1.12 P450酶活性测定82-83
• 5.1.13 7-羟基香豆素标准曲线制作83
• 5.1.14 蛋白含量测定83
• 5.2 结果83-86
• 5.2.1 Bacmid-CYP6X2与Bacmid-CPR重组质粒的构建83-85
• 5.2.2 昆虫杆状病毒表达载体异源表达CYP6B6重组蛋白85-86
• 5.3 讨论86-87
• 第六章 绿盲蝽CYP6X2基因的启动子87-97
• 6.1 材料与方法87-91
• 6.1.1 供试绿盲蝽及饲养方法87
• 6.1.2 试剂87-88
• 6.1.3 主要仪器88
• 6.1.4 启动子克隆引物的设计88
• 6.1.5 染色体步移法克隆启动子88-90
• 6.1.6 启动子报告基因载体的构建90-91
• 6.1.7 细胞转染91
• 6.1.8 启动子活性测定91
• 6.2 结果与分析91-95
• 6.2.1 CYP6X2基因启动子的克隆91-94
• 6.2.2 CYP6X2基因5’侧翼序列报告基因载体的构建94-95
• 6.2.3 CYP6X2基因5’侧翼序列不同长度片段启动子活性95
• 6.3 讨论95-97
• 第七章 山东滨州地区的绿盲蝽种群对高效氯氟氰菊酯菊酯的抗性机制97-102
• 7.1 材料与方法97-99
• 7.1.1 供试虫源及饲养97
• 7.1.2 化学试剂97
• 7.1.3 实验仪器97
• 7.1.4 羧酸酯酶活性的测定97-98
• 7.1.5 谷胱甘肽S-转移酶GSTs活性的测定98
• 7.1.6 P450酶活性测定98
• 7.1.7 钠离子通道基因点突变的检测98-99
• 7.1.8 数据统计分析99
• 7.2 结果分析99-101
• 7.2.1 三种解毒代谢酶的活性比较99-100
• 7.2.2 钠离子通道基因的氨基酸比较100
• 7.2.3 山东滨州地区L1015F点突变频率的检测100-101
• 7.3 讨论101-102
• 第八章 河北沧州绿盲蝽种群对毒死蜱的抗性机制102-111
• 8.1 材料与方法102-104
• 8.1.1 供试虫源及饲养102
• 8.1.2 化学试剂与仪器102
• 8.1.3 解毒代谢酶活性的测定102
• 8.1.4 乙酰胆碱酯酶活性抑制实验102-103
• 8.1.5 乙酰胆碱酯酶的克隆及序列对比103-104
• 8.1.6 数据统计分析104
• 8.2 结果分析104-109
• 8.2.1 河北沧州地区种群对有机磷杀虫剂的敏感性104
• 8.2.2 河北沧州种群与敏感品系的解毒代谢酶活性比较104-105
• 8.2.3 氧化毒死蜱对河北沧州种群的乙酰胆碱酯酶抑制105
• 8.2.4 绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因的克隆105-107
• 8.2.5 绿盲蝽乙酰胆碱酯酶的系统进化分析107-109
• 8.2.6 河北沧州种群AlAChEl中点突变Ala216Ser的检测109
• 8.3 讨论109-111
• 总结与展望111-112
• 参考文献112-132
• 致谢132-133
• 作者简介133

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本文编号：488674