LH诱导小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中相关调控网络的研究

发布时间：2017-07-03 13:28

  本文关键词：LH诱导小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中相关调控网络的研究

  更多相关文章： 卵母细胞成熟 条件性基因敲除小鼠 c GMP CNP EGFR

【摘要】：哺乳动物卵母细胞自出生前后到性成熟LH峰以前,一直停滞于第一次减数分裂前期。卵巢颗粒细胞分泌的CNP通过受体NPR2调控卵母细胞内高水平的c GMP是阻滞卵母细胞成熟的主要原因,LH峰出现后激活了EGF/EGFR信号通路,卵母细胞内c GMP水平下降,减数分裂恢复。由此可见,CNP/NPR2和EGF/EGFR信号通路对c GMP水平的调控是卵母细胞发育的关键。但目前关于FSH和LH对CNP/NPR2和EGF/EGFR通路具体的调控机理,以及这两条通路在LH介导的c GMP下调过程中所发挥的作用尚不清楚。本研究采用EGFR基因敲除小鼠作为主要研究对象,运用HE染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、实时定量PCR、酶联免疫分析法、放射免疫分析法、Western Blot等技术,从卵巢、卵泡、卵丘卵母细胞复合体和卵母细胞发育等方面,研究卵母细胞成熟过程中参与c GMP水平调控的相关信号通路以及各通路之间的关系。本研究所取得的主要结果如下:1.本试验中主要选用的遗传背景为C57BL/6J×129Sv的小鼠对促性腺激素应答效果良好,卵泡和卵母细胞发育正常。研究发现,22~24日龄C57BL/6J×129Sv野生型小鼠在PMSG(5 IU)诱导44~48 h后,卵巢表面获得的排卵前卵泡数量较多,卵泡内EGFR表达水平与分布正常;h CG继续诱导12 h后,输卵管内收集到大量MII期的卵母细胞,IVF的受精率偏低,但受精后胚胎发育良好,形态正常;IVM的自发成熟率较高,染色体形态规则。~2.卵母细胞成熟在Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中被显著抑制。Western Blot结果表明,Egfrfl/flCyp19Cre/+和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠卵巢颗粒细胞内EGFR蛋白水平显著下降,分别为对照组的35%和15%左右。应用PMSG和h CG进行超数排卵处理后,卵巢内的卵丘细胞紧紧包围卵母细胞,透明质酸酶很难将其从卵母细胞上剥离;Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠相对于对照组仍有60%左右处于GV期;此时从Egfrfl/flCyp19Cre/+和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠输卵管壶腹部收集到的卵母细胞数量都有明显降低,尤其是Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠,仅为对照组的18%左右,且成功排卵的卵母细胞中,部分仍处于GV期,Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠高达50%以上。3.卵巢颗粒细胞中CNP的产生受FSH的正调控和LH的负调控。通过对钠肽家族表达过程进行全基因组水平实时监测以及进一步转录和翻译水平的研究发现,FSH和LH/h CG仅对NPPC具有调控作用,而对NPPA和NPPB没有影响,且FSH上调NPPC表达,LH/h CG抑制NPPC表达。受体NPR2在壁层颗粒细胞和卵丘细胞中都有表达,在卵丘细胞略高,FSH/PMSG引起了NPR2 m RNA的缓慢提高,44 h后显著下降,LH/h CG处理3 h后抑制其表达。CNP对于体外培养的卵泡中LH介导的卵母细胞GVBD没有影响,但可有效促进体外培养的壁层颗粒细胞中c GMP的产生和抑制体外培养的卵丘卵母细胞复合体中卵母细胞GVBD的发生。体外培养的壁层颗粒细胞中,LH/h CG抑制了CNP诱导的c GMP的产生过程,即降低了壁层颗粒细胞对CNP的敏感性。此外,Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中,NPPC的表达仍响应LH调控发生了显著的下降,与野生型小鼠表现一致,说明EGFR的缺失不影响LH对NPPC的调控作用。4.EGF/EGFR通路调控LH介导的c GMP的早期迅速下降,但对于LH依赖性NPPC m RNA表达下调不是必要的。在活体和离体情况下,LH/h CG处理都导致了c GMP水平和NPPC m RNA的显著下降,但c GMP的下调非常迅速,早于NPPC m RNA的下降1 h以上。体外培养的小鼠卵泡经EGF样生长因子Areg处理后,卵泡中NPPC m RNA的表达受到抑制,等同于LH的抑制效果;并且Areg的抑制作用被EGFR激酶抑制剂AG1478完全阻止,但LH依赖性NPPC表达抑制对AG1478不敏感。卵泡中LH对NPPC的抑制作用在4类EGFR信号通路缺陷小鼠中也未受到影响,进一步表明,LH依赖性NPPC m RNA表达调控不是通过EGFR信号通路介导的。采用AG1478抑制体外培养的卵泡内EGFR的效应后,早期LH对c GMP水平的迅速下调被完全抑制;进一步研究发现,EGFR在LH诱导15~30 min内即发生了显著的磷酸化,表明EGF/EGFR参与了c GMP的早期调控,而配体CNP可能作用于后期的反应。Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠体外培养的排卵前卵泡中,c GMP的水平在LH诱导后发生了迅速的部分下降,但该下降不足以引发卵母细胞的GVBD。综上所述,本文选用在卵巢颗粒细胞中特异性敲除EGFR基因的小鼠模型,从细胞、组织和活体水平验证了CNP/NPR2和EGF/EGFR信号通路在卵母细胞发育和成熟过程中的关键调控作用。该过程中,c GMP水平受多条冗余信号通路的调控。EGF/EGFR通路调控LH介导的c GMP的早期迅速下降,对于卵母细胞成熟是必需的。本研究为理解卵母细胞的成熟调控提供了必要的实验依据,为临床上卵母细胞相关的不孕不育症的预防和治疗提供了新的研究思路。
【关键词】：卵母细胞成熟 条件性基因敲除小鼠 c GMP CNP EGFR
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 上篇 文献综述15-35
• 第一章 小鼠卵母细胞成熟调控的研究进展15-35
• 1.1 卵泡发育与卵母细胞成熟15-18
• 1.1.1 卵巢的结构与发育15-16
• 1.1.2 卵母细胞的发育过程16-17
• 1.1.3 卵泡各类体细胞与卵母细胞发育的关系17
• 1.1.4 激素控制与卵巢周期17-18
• 1.2 卵母细胞减数分裂的停滞与恢复18-21
• 1.2.1 卵母细胞第一次减数分裂停滞20-21
• 1.2.2 卵母细胞第一次减数分裂恢复21
• 1.3 卵母细胞减数分裂停滞与恢复的调控机理21-33
• 1.3.1 cAMP、cGMP和PDE3A在卵母细胞成熟过程中的作用22-24
• 1.3.2 细胞间隙连接在卵母细胞成熟过程中的作用24-25
• 1.3.3 CNP/NPR2 信号网络在卵母细胞成熟过程中的作用25-29
• 1.3.4 EGF信号网络在卵母细胞成熟过程中的作用29-33
• 1.4 研究目的与意义33-34
• 1.5 研究思路与方法34-35
• 下篇 试验研究35-98
• 第二章 试验用小鼠卵母细胞成熟与体外受精的测定35-44
• 2.1 引言35-36
• 2.2 材料与方法36-39
• 2.2.1 仪器用具36
• 2.2.2 材料试剂36
• 2.2.3 试验动物36-37
• 2.2.4 切片制备与苏木精-伊红（HE）染色37
• 2.2.5 超数排卵后卵丘卵母细胞复合体的分离37
• 2.2.6 免疫组织化学法37-38
• 2.2.7 小鼠卵母细胞的IVF和胚胎的体外培养38
• 2.2.8 卵母细胞的IVM38-39
• 2.2.9 卵母细胞免疫荧光法39
• 2.3 结果与分析39-43
• 2.3.1 PMSG处理后卵母细胞的发育39-40
• 2.3.2 小鼠卵母细胞的IVF和胚胎的体外培养40-41
• 2.3.3 卵母细胞的IVM与染色体形态观察41-43
• 2.4 讨论43
• 2.5 小结43-44
• 第三章 EGF/EGFR系统相关基因敲除鼠的繁育与鉴定44-62
• 3.1 引言44
• 3.2 材料与方法44-50
• 3.2.1 仪器用具44
• 3.2.2 材料试剂44-45
• 3.2.3 试验动物45
• 3.2.4 配种方案45-47
• 3.2.5 基因型鉴定47-48
• 3.2.6 排卵前卵泡的分离与培养48-49
• 3.2.7 卵巢颗粒细胞的分离49
• 3.2.8 Western Blot检测蛋白表达水平49-50
• 3.2.9 切片制备与HE染色50
• 3.2.10 超数排卵后卵丘卵母细胞复合体的分离50
• 3.2.11 统计学分析50
• 3.3 结果与分析50-60
• 3.3.1 小鼠的基因型鉴定50-52
• 3.3.2 Egfrfl/flCyp19Cre/+小鼠卵母细胞发育相关表型的研究52-55
• 3.3.3 Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠卵母细胞发育相关表型的研究55-60
• 3.4 讨论60-61
• 3.5 小结61-62
• 第四章 CNP/NPR2 在卵母细胞减数分裂过程中的作用研究62-78
• 4.1 引言62
• 4.2 材料与方法62-65
• 4.2.1 仪器用具62
• 4.2.2 材料试剂62-63
• 4.2.3 试验动物63
• 4.2.4 人卵泡液样品的收集63
• 4.2.5 人卵巢壁层颗粒细胞的培养63-64
• 4.2.6 小鼠排卵前卵泡的分离与培养64
• 4.2.7 RNA提取和q PCR检测64
• 4.2.8 CNP蛋白水平的RIA检测64-65
• 4.2.9 cGMP水平的EIA检测65
• 4.2.10 统计学分析65
• 4.3 结果与分析65-75
• 4.3.1 小鼠卵巢中FSH对NPPC表达有正调控作用而LH/hCG为负调控作用65-68
• 4.3.2 促性腺激素对CNP受体NPR2 的表达调控68-69
• 4.3.3 促性腺激素对CNP蛋白水平的表达调控69-71
• 4.3.4 CNP对cGMP水平以及卵母细胞成熟的调控71-74
• 4.3.5 LH/hCG信号降低壁层颗粒细胞对CNP诱导的敏感性74-75
• 4.3.6 CNP/NPR2 信号在EGFR颗粒细胞特异性敲除小鼠中的表达75
• 4.4 讨论75-77
• 4.5 小结77-78
• 第五章 卵泡中LH介导的CNP和EGF信号通路对CGMP和卵母细胞成熟的影响78-98
• 5.1 引言78-79
• 5.2 材料与方法79-81
• 5.2.1 仪器用具79
• 5.2.2 材料试剂79
• 5.2.3 试验动物79
• 5.2.4 cGMP水平的EIA检测79-80
• 5.2.5 排卵前卵泡的分离与培养80
• 5.2.6 卵丘卵母细胞复合体的体外培养80
• 5.2.7 RNA提取与q PCR检测80
• 5.2.8 Western Blot检测蛋白表达水平80-81
• 5.2.9 统计学分析81
• 5.3 结果与分析81-94
• 5.3.1 LH/hCG体内和体外诱导卵泡内c GMP下降81-82
• 5.3.2 LH处理后体外培养的排卵前卵泡中的NPPC mRNA水平82-83
• 5.3.3 体外培养的排卵前卵泡中EGF信号通路对NPPC mRNA相对水平的影响83-85
• 5.3.4 信号通路对LH依赖性cGMP抑制的影响85-87
• 5.3.5 rLH处理Egfrdelta/fl Cyp19Cre/+小鼠排卵前卵泡对cGMP水平的影响87-91
• 5.3.6 EGFR在野生型和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中的表达和激活91-93
• 5.3.7 LH/hCG对CNP依赖性cGMP产生的影响93-94
• 5.4 讨论94-97
• 5.5 小结97-98
• 研究结论98-99
• 创新点99-100
• 下一步研究工作100-101
• 参考文献101-113
• 缩略词表113-115
• 致谢115-116
• 个人简介116
• 发表学术论文116-117

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