镰刀菌和黄曲霉菌生防菌的分离及拮抗机理研究

发布时间：2017-07-17 04:03

  本文关键词：镰刀菌和黄曲霉菌生防菌的分离及拮抗机理研究

  更多相关文章： 镰刀菌 黄曲霉菌 生物防治 芽孢杆菌 依枯草菌素 丰原素 海藻希瓦氏菌 二甲基三硫

【摘要】：镰刀菌和黄曲霉菌是世界上侵染小麦、玉米、水稻、花生等多种粮食和油料作物的病原真菌,不仅降低作物品质和产量,造成巨大的经济损失,还在侵染植物过程中产生多种真菌毒素,人、畜误食后会引起中毒,严重时可致癌症和死亡。中国是农业大国,粮食的生产和品质关系着国家的经济发展和社会稳定。因此,开展镰刀菌和黄曲霉菌控制技术研究,对于保障我国粮食稳产高产和食品安全,具有重要意义。由于天然抗性资源匮乏,已鉴定和开发的抗病资源有限,传统育种方法未能有效控制这些病原菌及其毒素的危害。长期以来,镰刀菌和黄曲霉菌的防治以化学杀菌剂为主,导致了严重的环境污染和生态环境问题,诱发了病原菌的抗药性和产毒量的增强。所以,开发对生态和环境安全的生物防治技术,具有广泛的应用前景。为此,我们分别以禾谷镰刀菌和黄曲霉菌为靶标病原真菌,通过微生物源生防菌株的分离、筛选、代谢物解析以及作用机理研究,获得多个高活性拮抗菌,鉴定了主要抑菌物质的化学结构和作用靶点,并用于田间及储藏期的病原菌防治。以镰刀菌为靶标病原菌取得的主要研究结果如下:1.抑制镰刀菌的芽孢杆菌筛选。从中国9个省的不同生态环境中采集样品160份,分离得到1809个菌株,其中12个菌株能显著抑制禾谷镰刀菌生长,进一步用于孢子萌发、苗期接种、田间单花接种和喷雾接种等拮抗作用分析,最终获得具有高效抑菌活性的3株芽孢杆菌(S76-3,DM-3,DK-1),其孢子萌发抑制率97%,小麦苗腐病抑制率为46%-57%,小麦穗腐病的抑制率为67%-80%。筛选得到的高效菌株S76-3用于镰刀菌的田间防治和抑菌机理研究;2.拮抗菌及其无菌上清液抑菌活性测定。以抑菌活性最强的解淀粉芽孢杆菌S76-3为材料,以活菌数为指标优化发酵条件,筛选得到一个最优培养基(红糖23.3g/L,豆粉11.1 g/L,Ca CO3 4.9 g/L,KNO3 8 g/L,KH2PO4 0.5g/L,K2HPO4 1.2 g/L,Mg SO4·7H2O 5 g/L,Na Cl 3 g/L),发酵后活菌数达1010/ml以上;收集发酵液菌体,添加助剂后制备可湿性粉剂,活菌数达109/g以上。S76-3可湿性粉剂与无菌上清液稀释后的田间试验表明,S76-3菌体和无菌上清液在不同年份和品种中均可有效防治小麦赤霉病,以2013年为例,无菌上清液处理后的病情指数可降低52%,小麦籽粒毒素含量降低76%,显著优于常用化学杀菌剂多菌灵;S76-3菌体处理可降低13%的病情指数的,43%的毒素,明显弱于多菌灵;3.抑菌物质化学结构解析。S76-3菌株基因组测序结合PCR分析表明,该菌株含有脂肽类物质编码基因;薄层色谱和液相色谱质谱连用仪分析证实,S76-3菌株主要产生依枯草菌素、丰原素和表面活性素;进一步将这3种物质经碰撞诱导解离和质谱分析(ESI-CID-MS)表明,S76-3产生的脂肽物质为依枯草菌素A、丰原素A/B和表面活性素,每类物质分别含有2-4种同系物;4.脂肽类物质抑菌机理。利用高效液相收集上述3种脂肽物质,配置成不同浓度后用于体外抑制镰刀菌活性以及抑菌机理研究,结果表明,表面活性素不具有抑菌活性,依枯草菌素A和丰原素A可高效抑菌镰刀菌;光学显微镜分析表明,这2种物质均可破坏镰刀菌菌丝和孢子结构,导致真菌细胞膨大后丧失活性;透射电镜分析显示,这2种物质主要引起真菌细胞壁穿孔和细胞膜破裂,导致细胞死亡;实时显微跟踪分析表明,依枯草菌素A主要作用于真菌菌丝的侧端导致凸起,丰原素主要作用于菌丝生长点,使其异常膨大。以黄曲霉菌为靶标病原菌取得的主要研究结果如下:1.产气拮抗菌筛选与鉴定。从100余株海洋细菌中,通过双皿对扣抑菌试验,筛选获得可产生抑菌性挥发气体、对黄曲霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率高于80%的细菌5株,包括1株假单胞菌(Pseudomonas sp.)、1株希瓦氏菌YM8(Shewanella sp.)、2株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)和1株微球菌(Micrococcus sp.),其中海藻希瓦氏菌YM8的抑菌活性最强,对黄曲霉菌、镰刀菌等9种重要植物病原真菌的抑制率均为100%。以海藻希瓦氏菌YM8为材料进行储藏期黄曲霉菌及其毒素防治和抑菌机理研究;2.抑菌气体的化学结构解析。利用气相色谱质谱连用仪(GC-MS)对YM8产生的挥发性气体物质进行分析,结果表明,YM8可产生15种挥发性物质,包括芳香族,烷类,硫化物,烯醇类,VA唑类,蒽类,酯类以及酚类等8类物质,其中二甲基三硫丰度最高,相对含量达14.195%。从15种物质中选取相似度高于70%,相对含量高于0.5%的6种物质进行抑菌试验,结果表明,2,4-二叔丁基苯酚和二甲基三硫的抑菌作用最强,分别在浓度为100μg/L和200μg/L(物质重量/空间体积)时可完全抑制黄曲霉菌丝的生长和孢子萌发;其余4种物质,2,4-二甲基VA唑、2-十二烷醇、丁基羟基甲苯和壬烷也具有抑制黄曲霉菌的作用。其中2,4-二甲基VA唑和2-十二烷醇为首次报道对病原真菌具有抑制作用。丰度最高、抑菌活性最强的二甲基三硫,在YM8菌株的抑菌活性中具有重要作用;3.产气菌对粮食中黄曲霉抑菌效率分析。将YM8菌与接种黄曲霉孢子的花生、玉米籽粒共培养后检测结果表明,对照组样品中水活度越高发病率越高,毒素含量越大。高水活度下花生样品发病率为100%,毒素含量为54μg/g,玉米样品发病率为100%,毒素量为5.59μg/g,与此相比,YM8菌株可完全抑制花生、玉米籽粒黄曲霉菌生长和毒素合成,在3种水活度下的黄曲霉菌与产毒量均为0。扫描电子显微镜观察,未经YM8处理的花生,表面覆盖大量黄曲霉菌丝和孢子;而YM8处理组的花生表面,孢子不能萌发,没有菌丝及产孢结构,少量异常孢子形状畸形,表面干瘪皱缩,失去侵染和萌发能力;4.YM8序列测定及BAC文库构建。YM8全基因组测序结果表明,该菌株基因组大小为4-5 M bp;提取YM8菌株DNA构建大肠杆菌BAC文库,获得含有1152个克隆(片段长度为60 kb左右)的BAC文库用于后续克隆二甲基三硫编码基因。YM8菌株在基础培养基中抑菌作用较弱,通过在基础培养基中添加不同氨基酸,发现甲硫氨酸和半胱氨酸能显著提高抑菌活性,说明这2种含硫氨基酸为合成二甲基三硫的关键物质,可能参与二甲基三硫的代谢合成途径。
【关键词】：镰刀菌 黄曲霉菌 生物防治 芽孢杆菌 依枯草菌素 丰原素 海藻希瓦氏菌 二甲基三硫
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 缩略词表16-17
• 第一章：田间小麦赤霉病的生防菌株筛选与抑菌机理研究17-88
• 1 文献综述17-35
• 1.1 镰刀菌的种类和病害循环18-19
• 1.1.1 镰刀菌的种类与分布18
• 1.1.2 镰刀菌的病害循环18-19
• 1.2 镰刀菌的危害19-21
• 1.2.1 对作物产量的影响19-20
• 1.2.2 对作物品质的影响20
• 1.2.3 对人畜健康的危害20-21
• 1.3 镰刀菌毒素21-23
• 1.3.1 镰刀菌毒素的种类21-22
• 1.3.2 镰刀菌毒素的危害22-23
• 1.4 小麦赤霉病与毒素的防治23-27
• 1.4.1 田间耕作防除23-24
• 1.4.2 培育抗病品种24-25
• 1.4.3 化学防治25-26
• 1.4.4 生物防治26-27
• 1.5 赤霉病的微生物源生物防治27-30
• 1.5.1 生防芽孢杆菌27-28
• 1.5.2 生防假单胞菌28-29
• 1.5.3 生防放线菌29
• 1.5.4 生防木霉与酵母菌29-30
• 1.6 芽孢杆菌对镰刀菌的抑菌机理30-35
• 1.6.1 表面活性素31-32
• 1.6.2 依枯草菌素32-33
• 1.6.3 丰原素33-35
• 2 研究目的与意义35-36
• 3 材料和方法36-54
• 3.1 试验材料36-40
• 3.1.1 真菌菌株36
• 3.1.2 细菌菌株36
• 3.1.3 植物材料36
• 3.1.4 化学药品与试剂36-37
• 3.1.5 主要培养基配置37-40
• 3.1.6 仪器设备40
• 3.2 实验方法40-54
• 3.2.1 小麦赤霉病拮抗菌株的分离40-41
• 3.2.2 高效生防菌株的筛选41-44
• 3.2.3 筛选生防株S76-3 的田间防效44-46
• 3.2.4 菌株S76-3 的广谱抑菌作用46
• 3.2.5 生防菌S76-3 的形态学鉴定46
• 3.2.6 生防菌S76-3 的分子生物学分析46-49
• 3.2.7 生理生化鉴定49
• 3.2.8 生防菌S76-3 基因组测序49-51
• 3.2.9 S76-3 产脂肽类物质提取51
• 3.2.10 S76-3 产脂肽类物质TLC检测51-52
• 3.2.11 S76-3 产脂肽类物质液相色谱检测52
• 3.2.12 S76-3 产脂肽类物质质谱检测52
• 3.2.13 依枯草菌素A和丰原素A的最低抑菌浓度52-53
• 3.2.14 依枯草菌素A与丰原素A对菌丝与孢子的显微观察53
• 3.2.15 依枯草菌素A与丰原素A对菌丝与孢子的电镜观察53-54
• 4 结果与分析54-83
• 4.1 小麦赤霉病拮抗菌株的筛选54-59
• 4.1.1 小麦赤霉病拮抗菌株的分离与初步鉴定54-55
• 4.1.2 筛选拮抗菌对镰刀菌菌丝和孢子的抑制作用55-56
• 4.1.3 筛选拮抗菌对小麦苗腐病的抑制作用56-57
• 4.1.4 小麦赤霉病拮抗菌的田间单花接种57-59
• 4.2 生防菌S76-3 的生防效果59-63
• 4.2.1 生防菌S76-3 发酵上清的最低抑菌试验59
• 4.2.2 生防菌S76-3 可湿性粉剂制备59-60
• 4.2.3 生防菌S76-3 的田间小区试验60-63
• 4.3 生防菌S76-3 的广谱抑菌作用63-64
• 4.4 生防菌S76-3 鉴定64-65
• 4.5 解淀粉芽孢杆菌S76-3 代谢产物鉴定65-77
• 4.5.1 菌株S76-3 基因组分析65-68
• 4.5.2 菌株S76-3 脂肽类物质编码基因克隆68
• 4.5.3 菌株S76-3 脂肽类物质薄层色谱检测68-69
• 4.5.4 菌株S76-3 脂肽类物质液相色谱检测69-71
• 4.5.5 菌株S76-3 脂肽类物质ESI-MS检测71-73
• 4.5.6 菌株S76-3 脂肽类物质ESI-CID-MS检测73-77
• 4.6 解淀粉芽孢杆菌S76-3 抑菌机理研究77-83
• 4.6.1 依枯草菌素和丰原素的最低抑菌浓度77-79
• 4.6.2 依枯草菌素和丰原素对孢子与菌丝作用的显微观察79-80
• 4.6.3 依枯草菌素A和丰原素A对菌丝作用的动态监测80-81
• 4.6.4 依枯草菌素和丰原素对菌丝和孢子作用的电镜观察81-83
• 5 讨论83-88
• 第二章 花生、玉米黄曲霉的生防菌株筛选与抑菌机理研究88-133
• 1 文献综述88-99
• 1.1 黄曲霉88-90
• 1.1.1 黄曲霉菌的特征与分布88
• 1.1.2 黄曲霉菌的病害循环与流行88-89
• 1.1.3 黄曲霉菌的危害89-90
• 1.2 黄曲霉毒素90-94
• 1.2.1 黄曲霉毒素的种类与分布90-92
• 1.2.2 黄曲霉毒素对人体和动物的危害92-94
• 1.3 黄曲霉菌与毒素的防治94-99
• 1.3.1 培育抗病品种94
• 1.3.2 基因工程育种94-95
• 1.3.3 化学防治95-96
• 1.3.4 生物防治96-99
• 2 研究目的与意义99-100
• 3 材料和方法100-107
• 3.1 实验材料100-101
• 3.1.1 真菌菌株100
• 3.1.2 细菌菌株100
• 3.1.3 植物材料100
• 3.1.4 培养基和试剂100-101
• 3.1.5 仪器设备101
• 3.2 实验方法101-107
• 3.2.1 生防菌株YM8 的分离与鉴定101
• 3.2.2 生防菌株YM8 对黄曲霉的抑制作用101-102
• 3.2.3 活性碳对菌株YM8 抑菌作用的影响102-103
• 3.2.4 生防菌株YM8 挥发性代谢物质的GC/MS检测103
• 3.2.5 挥发性单物质的抑菌作用103-104
• 3.2.6 菌株YM8 对花生和玉米黄曲霉的防治104-105
• 3.2.7 生防菌株YM8 处理后籽粒扫描电镜观察105
• 3.2.8 生防菌株YM8 的温度适应性105-106
• 3.2.9 生防菌株YM8 的广谱抑菌作用106
• 3.2.10 生防菌株YM8 的基因组测序与功能分析106
• 3.2.11 生防菌株YM8 的Bac文库构建106-107
• 3.2.12 菌株YM8 构建Bac文库的筛选107
• 4 结果与分析107-128
• 4.1 产气拮抗菌YM8 的鉴定107-108
• 4.2 拮抗菌YM8 对黄曲霉的抑菌作用108-110
• 4.2.1 YM8 对菌丝生长的抑制作用108-109
• 4.2.2 YM8 对孢子萌发的抑制作用109
• 4.2.3 活性碳对YM8 抑制作用的影响109-110
• 4.3 YM8 产抑菌代谢物质的鉴定110-115
• 4.3.1 YM8 产挥发性气体的鉴定110-114
• 4.3.2 YM8 产挥发性气体的抑菌作用114-115
• 4.4 YM8 对花生和玉米黄曲霉的抑制115-118
• 4.5 YM8 的广谱抑菌作用118-119
• 4.6 YM8 不同温度下的抑菌作用119-120
• 4.7 菌株YM8 二甲基三硫编码基因克隆120-125
• 4.7.1 菌株YM8 产二甲基三硫底物筛选120-122
• 4.7.2 YM8 基因组二甲基三硫代谢通路预测122-125
• 4.8 菌株YM8 构建Bac文库的筛选125-128
• 4.8.1 YM8 基因组Bac文库构建125-127
• 4.8.2 Bac文库产二甲基三硫克隆筛选127-128
• 5 讨论128-132
• 6 展望132-133
• 参考文献133-154
• 附录154-156
• 致谢156-157

【参考文献】

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本文编号：551833