我国鸡群禽白血病病毒的多样性、致病性及其在免疫选择压下准种演变

发布时间：2017-07-17 21:53

  本文关键词：我国鸡群禽白血病病毒的多样性、致病性及其在免疫选择压下准种演变

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【摘要】：禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)已发现有一百多年,是第一个被证实可诱发肿瘤的病毒。根据病毒与宿主细胞特异性相关的囊膜蛋白的抗原性,ALV可分为A-J十个亚群,以及新鉴定的K亚群。其中,J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在鸡群中引起的以髓细胞样细胞瘤为主要病理表现的肿瘤病。1988年首次在英国发现并分离到该病毒,然后迅速传播到世界其它国家,并很快在全球几乎所有白羽肉鸡中蔓延。ALV-J自上世纪90年代传入中国鸡群后,其致病性逐渐演变。在最初十年,似乎仅在进口的白羽肉用型鸡中发生。但从2004年前后,ALV-J传入我国蛋用型鸡及培育型黄羽肉鸡中,且感染率与致肿瘤性日趋上升,最高时全群有30%肿瘤死亡率。特别是在ALV-J感染的蛋鸡群中出现了较高比例的体表血管瘤。在2007至2009年期间,ALV-J在我国商品代蛋鸡中呈爆发流行。在我国感染ALV-J的鸡群中,除了潜伏期较长(3-6个月)的典型髓细胞样细胞瘤和血管瘤外,还出现了携带v-src或v-fps的缺陷型ALV-J诱发的急性纤维肉瘤。最近五年来,ALV-J已经蔓延至我国多种遗传背景的纯地方品系鸡群中。本研究对ALV在我国地方品系鸡中的流行病学调查和致病性方面进行了系统研究,并首次利用高通量测序技术对ALV-J在宿主免疫选择压下准种多样性的演变进行了深入研究。1.我国地方品系鸡中禽白血病病毒的流行病学调查2011至2014年间,先后在山东、浙江和江苏各省的22个地方品系鸡中采集到270份不同的临床样品,并分别对每一个样品分离和鉴定ALV,共分离鉴定到47株禽白血病病毒,其中4株ALV-A(8.5%),2株ALV-C(4.3%),18株ALV-J(38.3%)和23株ALV-K(48.9%)。进化树分析表明,ALV-J与A、B、C、D和E五个经典亚群毒株以及ALV-K亚群分为2个进化枝。同时发现,从肿瘤鸡中分离到的大多是ALV-J,而从健康鸡中分离到的大多是ALV-A、ALV-C和ALV-K。另一方面,在我国地方品种鸡中K亚群有如此高的分离率,而从国外引进的白羽肉鸡和蛋鸡中迄今为止还从未分离到K亚群,这一流行病学现象表明,由本实验室鉴定的这个新的K亚群可能是一个在我国甚至东亚地区的地方品系鸡群中已长期存在的特有的亚群2.J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的致病性研究禽白血病病毒与其它病毒的共感染或多重感染情况非常普遍,为了更全面的了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)和网状内皮组织增生症病毒(REV)共感染对肉鸡和蛋鸡的致病作用,本文将该两种病毒单独感染或共感染1日龄商品代肉鸡和spf鸡,在不同时间对死亡率、体重、免疫器官指数和对疫苗的抗体反应等方面进行了系统研究。结果显示,无论对商品代肉鸡还是spf鸡,两种病毒共感染较单一感染诱发的死亡率更高、生长迟缓更加显著(p0.05);共感染组鸡的法氏囊和胸腺萎缩程度及对新城疫(nd)和禽流感(h9-ai)疫苗免疫后的抗体反应的抑制作用也更强(p0.05)。这些结果表明alv-j和rev的共感染对商品代肉鸡和spf鸡都具有显著的协同致病作用。3.j亚群禽白血病病毒相关急性肿瘤的致病性研究为了解alv-j相关的急性纤维肉瘤与特定的染色体核型之间的生物学关系及其致病性方面的特征,本文用肉瘤病料制备了肿瘤细胞,并尝试进行细胞系的构建,已连续培养42代,细胞状态良好。对第5代的肿瘤细胞进行核型分析发现,50个样品中有29例出现大染色体的多倍体现象,其中21例呈现第7号染色体的三倍体现象,其它的8例分别是第3、4、5(性染色体w)和10号染色体的多倍体现象。另外,有一例同时呈现7号和5号染色体的多倍体。人工造病试验发现,肿瘤细胞的第26代培养物的上清液同样可以诱发肉瘤。本试验首次对alv-j相关的急性肿瘤的核型进行了分析,发现了该alv-j相关的急性纤维肉瘤的核型具有多态性。同时,肿瘤细胞系的构建也为进一步了解这一带有肿瘤基因src的缺陷型alv-j的致病性提供了很好的体外研究平台。4.高通量测序方法对宿主免疫选择压下alv-j准种多样性的研究为了研究j亚群禽白血病病毒在宿主免疫选择压下准种多样性的演变,本试验用alv-jnx0101株人工接种spf鸡,经过36周动物试验观察,挑选3只持续病毒血症且有抗体反应鸡和3只呈持续病毒血症但无抗体反应鸡,在不同时间点(2w,4w,8w,12w,16w,20w,24w,28w,32w,36w)采集血浆提取病毒rna,利用高通量测序平台对gp85的两个高变区进行测序。获得了迄今为止alv-j准种方面最大的数据集,包含约300万cleanreads。对高通量测序结果进行生物信息学分析发现,宿主免疫选择压可以显著提高alv-j的准种多样性。同时,选择压力也促使优势变异株发生动态变化。根据有抗体鸡体内前、后期的优势变异株的序列分别构建了二个传染性克隆,并用相应时期的血清进行病毒交叉中和试验。结果表明,同一只感染鸡在前期产生的抗体和后期产生的抗体表现出显著不同的抗原特异性,显示出感染鸡体内的病毒和宿主抗体反应的共演变。在抗体阳性鸡血浆中病毒的优势变异株发生了较多的氨基酸替换,显示出抗体的选择压作用,而在抗体阴性鸡,优势变异株也没有发生显著改变。此外,我们在gp85中还发现了一个新的高变区(61-68位氨基酸)。据我们所知,本研究是第一次通过高通量测序在试验动物体内研究ALV-J准种的多样性和动态演变。我们的研究揭示了ALV-J与宿主免疫系统之间的相互作用关系。
【关键词】：禽白血病病毒 多样性 致病性 免疫选择压 准种
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 中文摘要11-14
• Abstract14-17
• 1 前言17-48
• 1.1 禽白血病病毒的研究进展17-34
• 1.1.1 禽白血病病毒的分类地位18
• 1.1.2 亚群分类18
• 1.1.3 禽白血病病毒的形态学与理化特征18-19
• 1.1.4 禽白血病病毒的基因组结构及蛋白组成19-23
• 1.1.5 ALV-J的来源23-24
• 1.1.6 禽白血病病毒的复制周期24-26
• 1.1.7 J亚群禽白血病病毒的致瘤机制26-27
• 1.1.8 我国鸡群ALV-J诱发肿瘤的多样性及特点27-30
• 1.1.9 我国鸡群中ALV-J感染发生发展的历史30-32
• 1.1.10 ALV-J的抗体和病毒血症存在情况32
• 1.1.11 ALV-J与其它肿瘤性病毒的共感染情况32-33
• 1.1.12 禽白血病的诊断33-34
• 1.2 高通量测序技术在病毒准种研究中的应用34-44
• 1.2.1 病毒的准种理论34
• 1.2.2 准种与变异株的区别与联系34-35
• 1.2.3 研究病毒准种的方法35-36
• 1.2.4 Sanger常规测序法36-37
• 1.2.5 主流高通量测序平台的介绍37-43
• 1.2.6 生物信息学在高通量测序领域中的应用43-44
• 1.3 ALV-J准种在宿主选择压下的研究进展44-46
• 1.3.1 体内研究ALV-J准种45
• 1.3.2 体外研究ALV-J准种45-46
• 1.3.3 高通量测序技术在研究ALV-J准种的优势46
• 1.4 本研究的目的及意义46-48
• 2 材料与方法48-63
• 2.1 试验材料48-49
• 2.1.1 毒株和细胞48
• 2.1.2 试验动物48
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒48-49
• 2.1.4 主要仪器49
• 2.2 试验设计及方法49-63
• 2.2.1 ELISA和IFA检测ALV-J的比较及我国地方品系鸡中ALV-J的流行病学调查49-53
• 2.2.2 ALV-J 和 REV 共感染对商品代肉鸡致病作用的试验设计53-54
• 2.2.3 ALV-J和REV共感染对SPF鸡的致病作用的试验设计54-55
• 2.2.4 ALV-J相关的急性肿瘤的致病性研究55-56
• 2.2.5 高通量测序方法对宿主免疫选择压下ALV-J准种多样性的研究56-63
• 3 结果与分析63-101
• 3.1 我国地方品系鸡中禽白血病病毒的流行病学调查63-71
• 3.1.1 不同抗原检测试剂盒和间接免疫荧光检测DF1细胞培养ALV-J的比较研究63-64
• 3.1.2 我国地方品系鸡中ALV的流行病学调查结果64-67
• 3.1.3 一例地方品系鸡（黄羽肉鸡）的病例分析67-71
• 3.2 ALV-J和REV共感染的致病性研究71-79
• 3.2.1 ALV-J和REV共感染对商品代肉鸡的协同致病作用的研究71-75
• 3.2.2 ALV-J和REV共感染对SPF鸡的协同致病作用的研究75-79
• 3.3 ALV-J相关的急性纤维肉瘤的致病性研究79-85
• 3.3.1 病毒滤过液接种海兰褐蛋鸡的结果79-80
• 3.3.2 组织培养细胞的形态学特征80-81
• 3.3.3 细胞染色体的数目81-82
• 3.3.4 染色体核型分析82-84
• 3.3.5 细胞培养上清液的致肿瘤性研究84-85
• 3.4 宿主免疫选择压下J亚群禽白血病病毒的准种多样性及其演变85-101
• 3.4.1 不同感染状态试验鸡的选择85-87
• 3.4.2 原始数据和处理后数据87-88
• 3.4.3 高通量测序与常规测序比较88
• 3.4.4 gp85-A和gp85-B片段的准种在抗体阳性和阴性鸡中的动态演变88-93
• 3.4.5 血浆中病毒准种多样性分析93-95
• 3.4.6 全局选择压力分析95
• 3.4.7 单位点氨基酸选择压力分析95-99
• 3.4.8 ALV准种和机体免疫系统的共演变99-101
• 4 讨论101-107
• 4.1 我国地方品系鸡中禽白血病病毒的流行病学调查101-103
• 4.2 J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的致病性研究103-104
• 4.3 J亚群禽白血病病毒相关急性肿瘤的致病性研究104-105
• 4.4 高通量测序方法对宿主免疫选择压下ALV-J准种多样性的研究105-107
• 5 结论107-108
• 6 参考文献108-123
• 7 致谢123-124
• 8 博士在读期间发表的论文124-126

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郭慧君;李中明;李宏梅;柴家前;马诚泰;王洪进;崔治中;;3种ELISA试剂盒检测不同亚型外源性鸡白血病病毒的比较[J];畜牧兽医学报;2010年03期

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本文编号：554766