解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白鉴定及抑菌机理研究

发布时间：2017-07-31 10:12

  本文关键词：解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白鉴定及抑菌机理研究

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【摘要】：真菌病害是引起作物减产与品质降低的主要因素。目前生物防治逐步替代化学农药是一种趋势,然而在生防菌中芽孢杆菌的抑菌作用尤为突出。本文以具有自主知识产权的解淀粉芽孢杆菌菌株HRH317为主要研究对象,对其代谢产生的抑制小麦赤霉病禾谷镰孢菌的抗菌蛋白进行了研究,为其在生物防治应用领域提供理论依据。具体研究内容包括：优化了抗菌蛋白的发酵条件；分离纯化与鉴定了抗菌蛋白；研究了抗菌蛋白的稳定性；阐明了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌的作用机理；验证了抗菌蛋白的防效、土壤中定殖力及生物安全性评价,结果如下。利用统计学方法优化了菌株HRH317抗菌蛋白的发酵条件。结果表明,抗菌蛋白的发酵最佳条件：在装有30mL pH值为7.0的NB培养液中,接种量4%,37℃下振荡培养24h,转速200r/min,菌株产抗菌蛋白的抑菌效果达到最佳。菌株HRH317发酵液经饱和硫酸铵沉淀得到蛋白粗提物,经DEAE Sepharose Fast Flow与Sephadex G-200柱层析分离纯化得到强烈抑制禾谷镰孢菌的抗菌蛋白。通过SDS-PAGE电泳检测,结果发现：呈现出一条单独条带,其表观分子质量约为36.0kD,测得抗菌蛋白含量为5.81±0.04mg/mL。采用HPLC法检测出抗菌蛋白氨基酸组成成分。抗菌蛋白经过SDS-PAGE电泳之后,将条带切下进行胶内胰蛋白酶酶切,采用纳升液相电喷雾串联质谱(NanoLC-ESI/MS/MS)分析鉴定。经电喷雾串联质谱共获得3个具有代表性的肽序列,分别为ELISNASDALDK、DIQMTQSPSSLSASVGDR. DSTYSLSSTLTLSKo在Matrix Science NCBI数据库中鉴定,尚无发现完全和这些肽段的氨基酸相同的序列。其中发现1个具有相关性的蛋白质,与芽孢杆菌分泌的草酸脱羧酶部分同源,表明菌株HRH317所产抗菌蛋白是一种新的蛋白质。抗菌蛋白稳定性研究结果显示,对热、酸碱有良好的稳定性,对蛋白酶K不敏感、而对胰蛋白酶、胃蛋白酶较敏感；经紫外线照射与反复冻融以后仍然具有良好的抑菌活性。抗菌蛋白抑菌谱非常广,对常见的12种病原菌都有明显抑菌作用,表明了该抗菌蛋白在植物真菌病害防治和食品防腐方面具有广阔的开发与应用前景。采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、细胞膜通透性测定等方法,初步明确了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌的作用机理。揭示了抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌菌丝生长,抑制孢子萌发,同时造成病原菌细胞器紊乱,细胞质降解,膜通透性增大。同时,该抗菌蛋白对细胞壁的破坏也是重要机理之一,但对禾谷镰孢菌菌丝中蛋白质的合成无显著影响,禾谷镰孢菌蛋白质SDS-PAGE电泳图谱检测结果与之吻合。本文通过光照培养箱及盆栽试验发现,解淀粉芽孢杆菌HRH317对由禾谷镰孢菌引起的小麦赤霉病的防治效果明显,经处理的小麦根部病情指数较对照降低了62.5%,并且有很好的促生作用。经浸种和灌根处理后,该菌株能够很好的在土壤中定殖。经过对回收的土壤中拮抗菌HRH317进行抑菌试验研究表明仍具有抑菌活性,抑菌圈直径达到19.6cm。菌株HRH317通过急毒性试验,结果显示对小白鼠没有致病性,证明了该菌株良好的生物安全性。
【关键词】：解淀粉芽孢杆菌 抗茵蛋白 分离纯化 抑菌机理 生防应用
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476
【目录】：

• 摘要9-11
• 第一章 文献综述11-28
• 1. 作物病害生物防治研究概况11-13
• 1.1 小麦赤霉病的发生与危害11
• 1.2 生物防治11-13
• 1.3 生物防治的发展趋势13
• 2. 解淀粉芽孢杆菌的研究进展13-15
• 2.1 菌株分离、筛选及鉴定13-14
• 2.2 菌株产生的抗菌物质14-15
• 3. 抗菌物质分离、纯化及鉴定15-19
• 3.1 抗菌物质活性的测定15-16
• 3.2 抗菌物质的分离、纯化16-17
• 3.3 抗菌物质的鉴定17-19
• 4. 抗菌物质抑菌机理19-23
• 4.1 竞争作用20
• 4.2 拮抗作用20-22
• 4.3 诱导抗性22-23
• 5. 解淀粉芽孢杆菌对作物真菌病害生物防治研究现状23-26
• 5.1 在作物真菌病害方面的应用23-24
• 5.2 在果蔬防腐与保鲜上的应用24-25
• 5.3 在生物防治上存在的问题及措施25-26
• 6. 本研究的目的和意义26-27
• 7. 本研究设计思路27-28
• 第二章 解淀粉芽孢杆菌HRH317产抗菌蛋白发酵条件优化28-40
• 1. 材料与仪器28-29
• 1.1 材料28-29
• 1.2 主要仪器29
• 2. 试验方法29-31
• 2.1 HRH317菌株种子液的制备29
• 2.2 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的制备29-30
• 2.3 指示菌菌悬液的制备30
• 2.4 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的抑菌活性测定30
• 2.5 HRH317菌株产抗菌蛋白发酵条件的优化30-31
• 3. 结果与分析31-38
• 3.1 单因素试验31-34
• 3.2 响应面分析34-38
• 4. 讨论38-39
• 5. 小结39-40
• 第三章 解淀粉芽孢杆菌HRH317所产抗菌蛋白的分离纯化40-51
• 1. 材料与仪器40-41
• 1.1 材料40
• 1.2 主要仪器40-41
• 2. 试验方法41-43
• 2.1 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的制备及抑菌活性41
• 2.2 不同饱和度硫酸铵分级沉淀抗菌粗蛋白41
• 2.3 HRH317菌株抗菌蛋白的分离纯化41-42
• 2.4 HRH317菌株抗菌蛋白分子量测定42
• 2.5 抗菌蛋白含量的测定42
• 2.6 HPLC测定抗菌蛋白氨基酸组成分析42
• 2.7 抗菌活性测定方法42-43
• 3. 结果与分析43-49
• 3.1 抗菌蛋白粗提液抑菌活性检测43
• 3.2 最适饱和度硫酸铵沉淀抗菌粗蛋白的确定43-44
• 3.3 HRH317菌株抗菌蛋白的分离纯化44-46
• 3.4 SDS-PAGE检测HRH317抗菌蛋白分子量46-47
• 3.5 蛋白含量测定47-48
• 3.6 HPLC测定抗菌蛋白氨基酸组成分析48-49
• 4 讨论49-50
• 5 小结50-51
• 第四章 解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白的鉴定51-61
• 1. 材料与仪器51-52
• 1.1 材料51
• 1.2 主要仪器51-52
• 2. 试验方法52
• 2.1 纳升液相电喷雾串联质谱(NanoLC-ESI/MS/MS)分析52
• 2.2 质谱数据检索和分析52
• 3. 结果与分析52-59
• 3.1 抗菌蛋白的NanoLC-ESI/MS/MS质谱分析52-59
• 4. 讨论59
• 5. 小结59-61
• 第五章 解淀粉芽孢杆菌HRH317所产抗菌蛋白稳定性及抑菌谱研究61-71
• 1. 材料与仪器61-62
• 1.1 材料61-62
• 1.2 主要仪器62
• 2. 试验方法62-63
• 2.1 抗菌蛋白的制备62
• 2.2 温度对抗菌蛋白抑菌活性的影响62
• 2.3 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响62
• 2.4 蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响62
• 2.5 紫外线、反复冻融对抗菌蛋白抑菌活性的影响62-63
• 2.6 抗菌蛋白抑菌谱测定63
• 2.7 抑菌活性测定63
• 3. 结果与分析63-69
• 3.1 温度对抗菌蛋白抑菌活性的影响63-64
• 3.2 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响64
• 3.3 蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响64-66
• 3.4 紫外线、反复冻融对抗菌蛋白抑菌活性的影响66
• 3.5 抗菌蛋白抑菌谱66-69
• 4. 讨论69-70
• 5. 小结70-71
• 第六章 抗菌蛋白抑制禾谷镰孢菌的机理研究71-83
• 1. 材料与仪器71-72
• 1.1 材料71
• 1.2 主要仪器71-72
• 2. 试验方法72-74
• 2.1 抗菌蛋白的制备72
• 2.2 抗菌蛋白对病原菌孢子萌发的抑制作用72
• 2.3 抗菌蛋白对病原菌菌丝形态的抑制作用72
• 2.4 抗菌蛋白对病原菌菌丝细胞超微结构的影响72-73
• 2.5 抗菌蛋白对病原菌菌丝细胞壁的影响73
• 2.6 抗菌蛋白对病原菌细胞膜通透性的影响73
• 2.7 抗菌蛋白对病原菌菌丝蛋白质合成的影响73-74
• 2.8 禾谷镰孢菌蛋白质SDS-PAGE电泳检测74
• 3. 结果与分析74-80
• 3.1 抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发的影响74
• 3.2 抗菌蛋白对禾谷镰孢菌菌丝形态的影响74-76
• 3.3 抗菌蛋白对禾谷镰孢菌菌丝体细胞超微结构的影响76-78
• 3.4 抗菌蛋白对病原菌菌丝细胞壁的影响78
• 3.5 抗菌蛋白对病原菌细胞膜通透性的影响78-79
• 3.6 抗菌蛋白对病原菌菌丝蛋白质合成的影响79-80
• 3.7 抗菌蛋白处理禾谷镰孢菌蛋白质SDS-PAGE电泳分析80
• 4. 讨论80-81
• 5. 小结81-83
• 第七章 菌株HRH317的生防应用及生物安全性评价研究83-92
• 1. 材料与仪器83-84
• 1.1 材料83-84
• 1.2 主要仪器84
• 2. 试验方法84-86
• 2.1 解淀粉芽孢杆菌HRH317对小麦赤霉病的防效测定84-85
• 2.2 解淀粉芽孢杆菌HRH317土壤中定殖能力的测定85
• 2.3 生防菌株HRH317生物安全性的初步评价85-86
• 3. 结果与分析86-90
• 3.1 解淀粉芽孢杆菌HRH317对小麦赤霉病的防效与促生影响86-88
• 3.2 解淀粉芽孢杆菌HRH317土壤中定殖的能力88-89
• 3.3 解淀粉芽孢杆菌HRH317生物安全性初步评价89-90
• 4 讨论90-91
• 5 小结91-92
• 全文结论92-93
• 缩略表93-94
• 参考文献94-105
• Abstract105-107
• 攻读博士期间发表的论文107-109
• 致谢109

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