大白菜BrANT基因克隆及功能分析

发布时间：2017-08-05 09:21

本文关键词：大白菜BrANT基因克隆及功能分析

【摘要】：大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中国,是我国的特产蔬菜。长期以来,大白菜一直是我国和东亚国家栽培面积最大的蔬菜作物之一。经过漫长的自然进化和长期的人工栽培、选育,大白菜逐步形成了以储藏营养为功能的叶球,叶球是食用的最主要器官。叶球的大小是一个重要的产量性状,也是一个重要的商品性状。随着生活水平的不断提高,人们对大白菜叶球的大小提出了多种需求。大白菜叶球大小发育的分子调控机制及其在育种实践中的有效利用是一个重要的科学问题。但是,到目前为止,人们对大白菜叶球大小发育的分子调控机制知之甚少。通过对模式植物拟南芥的研究,人们发现隶属于AP2亚家族转录因子的ANT(AINTEGUMENTA)是控制叶子等器官大小发育的重要因素之一。本研究利用大白菜基因组数据,在全基因组水平上分析了大白菜AP2亚家族的成员组成、结构域构成、对应基因的结构、表达模式,并以Br ANT2基因为代表研究了AP2亚家族基因在控制叶球等器官大小方面的生物学功能。由于大白菜ANT基因对叶球大小发育的调控是一个复杂的生物学过程,涉及到多个基因的协同作用,因此我们又利用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术研究了Br ANT2基因过量表达后其它基因的转录表达差异情况。主要结果如下:1.大白菜AP2蛋白亚家族的生物信息学分析依照大白菜基因数据库测序数据(Chiifu)发现大白菜基因组中共存在24个AP2亚家族成员,它们不均匀地分布在10条染色体上,编码区(CDS)长度为549-1740bp。24个AP2亚家族成员包含的内含子数目也呈不均匀分布,但多数成员含有6个内含子。通过对24个成员的蛋白质序列特征进行分析,我们发现所有成员均具有两个相对保守的AP2结构域(R1,R2)。根据R1,R2氨基酸组成的数目,我们将AP2亚家族分为7个类型,其中?73,65‘型、?70,65‘型、?63,64‘型为三个主要类型。根据系统进化树的分析结果,我们将大白菜AP2亚家族成员分成Ⅰ-Ⅷ8个分枝,其中大白菜Br ANT成员聚类于Ⅵ号分枝上;在进化上,大白菜和拟南芥之间具有比水稻更近的亲缘关系。2.大白菜Br ANT蛋白家族的表达模式分析采用RT-PCR方法分析了大白菜Br ANT基因在大白菜根、短缩茎、老叶、幼叶、花和花蕾六部分组织中的表达模式,结果表明:Br ANT家族成员在不同组织中的表达存在较大差异。通过对大白菜Br ANT基因在NAA处理后不同时间点成熟叶中的表达模式分析,我们发现大白菜Br ANT基因在NAA早期响应中上调表达,后逐渐趋于正常。进一步的研究发现,不同家族成员之间的表达模式存在一定的差异,但具有相同结构域组成的成员具有类似的表达模式。上述结果表明:不同家族成员在大白菜叶球等器官发育调控中可能发挥不同的作用。3.大白菜Br ANT2的克隆和功能分析为更好研究Br ANT基因家族的生物学功能,我们选择了大白菜Br ANT2基因为代表进行分析。大白菜Br ANT2基因位于第3号染色体上,基因全长为2250bp,编码区(CDS)长度为1671 bp,编码556个氨基酸残基。利用RT-q PCR分析大白菜Br ANT2基因在叶球大小不同的品种之间结球期的表达模式,我们发现Br ANT2基因表达量与叶球大小呈正相关。在拟南芥中过量表达Br ANT2基因可显著提高转基因植株叶子等器官的大小,同时种子的千粒重也增加。因此,我们可以将Br ANT2基因应用于大白菜、油菜等十字花科蔬菜作物遗传改良中,利用分子育种手段提高这些蔬菜作物的经济产量,增加其经济效益。4.野生型及其转基因(35S:Br ANT2)拟南芥转录表达谱分析利用高通量转录组测序技术对播种后30天的转基因(35S:Br ANT2)拟南芥及其野生型叶中的基因转录表达谱进行了分析。结果表明,在野生型拟南芥和转基因(35S:Br ANT2)拟南芥中共有119个基因存在显著表达差异,其中40个基因在转基因(35S:Br ANT2)拟南芥中显著上调,79个基因在转基因(35S:Br ANT2)拟南芥中显著下调。通过对差异表达基因的深入分析,我们得出两点结论:第一,大白菜Br ANT基因可能通过复杂的基因网络调控叶子等器官大小的发育;第二,大白菜Br ANT基因可能通过上调与细胞周期、转录因子、钙调蛋白以及光形态建成相关基因和下调伸展蛋白基因、衰老相关蛋白基因来调控叶子等器官大小的发育。
【关键词】：大白菜 BrANT基因 器官大小 转基因株系 表达模式
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S634.1
【目录】：

摘要2-4
Summary4-11
前言11-12
第一章文献综述12-20
1.1 植物中AP2/EREB基因家族研究进展12-17
1.1.1 AP2/EREB基因家族结构特点与分类12-13
1.1.2 AP2/EREB基因家族起源与进化13-14
1.1.3 AP2/EREB转录因子的作用14-17
1.2 ANT功能研究进展17-19
1.2.1 ANT结构特点及分类17-18
1.2.2 ANT功能18-19
1.3 试验目的及意义19-20
第二章 AP2亚家族生物信息学分析20-35
2.1 方法20-21
2.1.1 生物信息检索20
2.1.2 大白菜AP2亚家族成员鉴定20
2.1.3 序列分析方法20
2.1.4 蛋白质理化性质分析20
2.1.5 系统进化树构建方法20-21
2.1.6 模体（Motif）结构分析21
2.1.7 基因结构分析21
2.1.8 简单重复序列（SSR）分析21
2.1.9 基因染色体分布分析21
2.1.10 大白菜AP2亚家族成员表达模式分析21
2.2 结果与分析21-33
2.2.1 大白菜AP2亚族成员基本信息21-23
2.2.2 大白菜AP2结构域基本信息23-25
2.2.3 大白菜AP2亚家族基因结构25
2.2.4 大白菜AP2亚家族简单重复序列基本信息25-26
2.2.5 大白菜亚家族成员共线性信息26-27
2.2.6 大白菜AP2亚家族染色体定位27-28
2.2.7 大白菜AP2亚家族氨基酸序列比对分析28-29
2.2.8 AP2亚家族系统进化分析29-30
2.2.9 大白菜AP2亚家族进化树及模体分析30-32
2.2.10 大白菜AP2亚家族基因表达模式分析32-33
2.3 小结33-35
第三章大白菜Br ANT基因克隆与功能分析35-57
3.1 材料35-36
3.1.1 试验材料35
3.1.2 大肠杆菌、农杆菌菌株和载体35-36
3.1.3 生化试剂36
3.2 方法36-45
3.2.1 植物组织DNA提取36
3.2.2 RNA提取36-37
3.2.3 反转录37
3.2.4 荧光定量PCR引物设计及反应参数37-38
3.2.5 DNA胶回收38
3.2.6 质粒提取38-39
3.2.7 目的基因克隆39-40
3.2.8 目的基因转化克隆载体40-41
3.2.9 超表达载体构建41-42
3.2.10 农杆菌转化42
3.2.11 农杆菌介导拟南芥转化42-44
3.2.12 转基因拟南芥筛选44
3.2.13 PCR检测转基因植株44
3.2.14 转基因植株表型形状研究44-45
3.3 结果与分析45-55
3.3.1 基因克隆45
3.3.2 大白菜Br ANT基因家族表达模式分析45-48
3.3.3 转基因株系目的基因表达分析48-49
3.3.4 转基因植株幼苗表型分析49-51
3.3.5 转基因（35s:Br ANT2）拟南芥成熟期表型分析51-53
3.3.6 温度胁迫对转基因拟南芥幼苗影响53-54
3.3.7 盐胁迫对转基因拟南芥幼苗影响54-55
3.4 讨论55-57
第四章转基因（35S:Br ANT2）拟南芥转录组分析57-75
4.1 材料57
4.1.1 试验材料57
4.1.2 生化试剂57
4.2 方法57-62
4.2.1 RNA提取及反转录57
4.2.2 转录组测序57
4.2.3 文库构建57-58
4.2.4 文库质量检测及上机测序58
4.2.5 测序数据及其质量控制58-59
4.2.6 测序数据生物信息学分析59-61
4.2.7 差异表达基因的荧光实时定量PCR（RT-qPCR）验证61
4.2.8 差异表达基因的GO功能显著性富集分析61-62
4.3 结果与分析62-72
4.3.1 RNA-Seq测序数据质量分析62-65
4.3.2 RNA-Seq测序数据分析65-66
4.3.3 基因表达模式分析66-70
4.3.4 差异表达基因的RT-q PCR验证70-72
4.4 讨论72-75
4.4.1 参与调控细胞生长的差异表达基因72-73
4.4.2 光形态建成相关差异表达基因73
4.4.3 生长发育相关差异表达基因73-74
4.4.4 编码钙信号传导相关蛋白的差异表达基因74
4.4.5 衰老相关蛋白的差异表达基因74-75
第五章结论75-76
附录1：真核克隆载体pMD 18-T图谱76-77
附录2：过量表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS图谱77-78
附录3：DNA、RNA质量检测图片78-79
附录4：PMD18-T- Br ANT2和pCAMBIA-35S-OCS空载体的双酶切79-80
附录5：pCAMBIA-35S-OCS-Br ANT2菌落PCR及双酶切检测80-81
附录6：转基因植株纯合体筛选81-82
参考文献82-96
致谢96-97
导师简介97-98
作者简介98-99

【共引文献】

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