辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立与流行情况调查

发布时间：2017-08-13 09:36

  本文关键词：辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立与流行情况调查

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征在世界各地广泛流行,对养猪业造成了巨大的经济损失。近年来国内猪群中不断检测到欧洲型PRRSV,而且欧洲型毒株感染有上升趋势。欧洲型病毒株的感染不但可以引起猪只死亡,也能引起免疫抑制,同时还影响高致病性猪蓝耳病的防控工作。本论文以自然发病病例为基础,从病原学、病理学和分子生物学等多方面进行诊断方法的研究,并对分离毒株进行全基因测序,分析遗传变异特点,在此基础上建立PRRSV多重PCR鉴别诊断方法及间接ELISA检测方法,对辽宁地区开展欧洲型PRRSV流行情况调查,分析了发病原因并提出防控建议。用Marc-145细胞从疑似PRRS仔猪病料中分离到一株病毒,经电镜观察、中和试验、PCR鉴定和基因序列分析确定为欧洲型PRRSV(命名为LNEU12);通过仔猪感染试验对欧洲型PRRS的临诊表现、病理变化特点和病毒抗原在组织分布情况进行了全面的研究,初步建立了欧洲型PRRS的诊断方法,并证实辽宁地区存在欧洲型PRRSV。采用RT-PCR方法对辽宁分离株LNEU12的全基因序列进行分段扩增,并进行了序列分析。LNEU12毒株基因全长15083bp(不含尾部),Gen Bank登陆号为KM196101(已公布)。LNEU12毒株有8个开放阅读框,与国内外14株欧洲型PRRSV的核苷酸同源性为83.7%~93.0%,其中与欧洲型标准毒株LV同源性为90.1%,而与美洲型标准毒株VR2332株同源性仅为59.6%。与欧洲型标准毒株LV比较缺失了18个核苷酸,在NSP2氨基酸的358~359和409位点分别缺失了4个和1个氨基酸,在ORF3、ORF4基因重叠区域缺失了3个碱基。针对欧洲型毒株ORF7和美洲型毒株NSP2基因序列用Oligo 7.0软件设计2对特异性引物建立了多重PCR检测方法,该方法可以特异性扩增出欧洲型毒株、美洲型经典毒株和变异毒株的目的基因,片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。用重叠延伸PCR将欧洲型PRRSV N蛋白特异性线性抗原A、C位点的基因进行重复串联,合成186bp的DNA基因片段。采用原核表达系统将串联基因序列高效表达,获得32.8k D的重组蛋白(含GST标签),经Western-blot检测,该重组蛋白能与欧洲型PRRS阳性血清发生免疫反应,并且具有较高的特异性。用纯化后的重组蛋白包被酶标板,建立了特异性检测欧洲型PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法可以有效区别美洲型、欧洲型毒株的中和抗体。用建立的间接ELISA方法对辽宁地区欧洲型PRRSV进行血清学调查,结果显示个体抗体阳性率为0.51%,猪场抗体阳性率为4.55%;用多重PCR方法对57个猪场271份疑似病料进行PRRSV病原调查,美洲型变异毒株检出率为12.55%,经典毒株检出率为1.11%,欧洲型毒株检出率为为2.21%。以上结果显示,辽宁地区PRRSV的流行是以美洲型变异毒株为主,同时存在欧洲型毒株和美洲型经典毒株,欧、美毒株共存已成为辽宁地区PRRSV流行的新特点。根据分离毒株相关基因同源性比较分析,推测辽宁流行的欧洲型病毒株可能是由引种或猪只流动时带入的,并发生了一定变异而出现的欧洲型PRRSV变异毒株。根据辽宁地区欧洲型PRRS的流行特点,提出了该病的综合防控措施,为辽宁地区欧洲型PRRS的净化、预防和控制提供了参考建议。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征 欧洲型 诊断 方法建立 流行情况调查 辽宁地区
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩略词表12-14
• 引言14-16
• 第一篇 文献综述16-44
• 第1章 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展16-36
• 1.1 PRRS发病历史16-17
• 1.2 PRRSV的生物学特征17-18
• 1.3 病毒基因组结构与功能研究18-23
• 1.4 PRRSV的基因组遗传变异特点23-26
• 1.5 PRRS的流行病学特征26-28
• 1.6 发病机制28-31
• 1.7 PRRS的临床症状31-32
• 1.8 PRRS的病理变化32-33
• 1.9 PRRS免疫学特点33-35
• 1.10 PRRS的综合防控现状与展望35-36
• 第2章 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的研究进展36-44
• 2.1 病毒分离36
• 2.2 病毒抗原的检测技术36-37
• 2.3 PRRS病毒基因检测37-39
• 2.4 抗体检测技术39-41
• 2.5 其他检测方法41-44
• 第二篇 研究内容44-108
• 第3章 欧洲型PRRS病原学诊断研究44-58
• 3.1 材料与方法44-49
• 3.2 结果49-55
• 3.3 讨论55-56
• 3.4 小结56-58
• 第4章 欧洲型PRRS病理形态学研究58-66
• 4.1 材料与方法58-60
• 4.2 结果60-64
• 4.3 讨论64-65
• 4.4 小结65-66
• 第5章 欧洲型PRRSV辽宁分离株全基因测序与遗传进化分析66-78
• 5.1 材料与方法66-68
• 5.2 结果68-74
• 5.3 讨论74-75
• 5.4 小结75-78
• 第6章 欧洲型、美洲型PRRSV鉴别诊断方法的建立78-86
• 6.1 材料与方法78-81
• 6.2 结果81-84
• 6.3 讨论84-85
• 6.4 小结85-86
• 第7章 基于N蛋白特异性抗原表位ELISA检测方法的建立86-98
• 7.1 材料与方法86-91
• 7.2 结果91-96
• 7.3 讨论96-97
• 7.4 小结97-98
• 第8章 辽宁地区欧洲型PRRSV流行情况调查及病因分析98-108
• 8.1 材料与方法98-100
• 8.2 结果100-103
• 8.3 讨论103-107
• 8.4 小结107-108
• 结论108-110
• 参考文献110-132
• 攻读博士期间取得的主要科研成果132-134
• 导师简介134-136
• 作者简介136-138
• 致谢138

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