丹参种质资源及其遗传多样性研究

发布时间：2017-08-17 16:13

  本文关键词：丹参种质资源及其遗传多样性研究

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【摘要】：丹参来源于唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎,是我国传统大宗药材之一,在中国和其他一些亚洲国家均有分布。其性微寒,味苦,具有活血调经,祛瘀止痛,凉血止痛,养血安神等功效。丹参的主要有效成分为二萜醌类和酚酸类,常用于治疗心脑血管等疾病。作为传统中药,丹参在我国栽培与应用历史悠久,然而对于丹参种质资源库的构建及不同来源种质间的遗传多样性研究并不多,尤其是航天诱变丹参种质的遗传多样性关系尚无相关报道。基于此,本论文以航天诱变第二、三代(SP2、SP3代)、不同形态和我国主要分布区野生居群的丹参种质材料为研究对象,探讨了航天诱变对SP2代丹参种质根产量和有效成分变异的影响;构建了含有133份丹参种质材料的种质资源库,其中包括62份航天诱变SP3代丹参种质、53份不同形态丹参种质、6份栽培丹参种质、6份野生丹参种质和6份地面对照丹参种质;利用生物学性状、生理生化、分子标记、有效成分和抗氧化活性等指标对丹参种质资源进行了系统的遗传多样性研究与评价;同时运用两种单引物扩增分子标记技术阐明了9个野生丹参居群的遗传多样性和遗传结构,为丹参种质资源的收集、种质资源库的构建及优良种质的筛选提出建议,为丹参药材的可持续利用与发展奠定理论基础。主要研究结果如下:1.航天诱变对SP2代丹参种质根产量和有效成分变异的影响研究与评价。对28个SP2代丹参株系根产量(鲜重和干重)的分析表明,二者变异幅度极大,与地面对照丹参种质(CK)相比,其鲜重和干重的变化范围分别为38-194%和42-203%。对SP2代丹参种质根11个有效成分的分析表明,丹参酮类成分平均含量变化范围分别为:0.32-1.04 mg g-1(丹参酮I),0.47-2.39 mg g-1(丹参酮ⅡA),0.25-1.60 mg g-1(隐丹参酮),0.53-1.67 mg g-1(二氢丹参酮I);酚酸类成分中,除丹酚酸B既有升高又有降低外,其余6个有效成分:丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸和肉桂酸的平均含量均高于CK。主成分分析可较好的将SP2代丹参种质和CK区分开来。上述结果说明,航天诱变对SP2代丹参种质根产量和有效成分含量影响显著。2.丹参种质资源库的构建及其生物学性状变异研究。在前期研究基础上,以62份SP3代丹参种质和53份不同形态丹参种质为核心,结合6份栽培丹参种质、6份野生丹参种质和6份地面对照丹参种质,构建了共有133份种质材料的丹参种质资源库。利用11个质量性状和20个数量性状对丹参种质资源地上部分生物学性状变异进行了分析,发现31个生物学性状变异丰富,多样性程度较高,多样性指数变化范围为2.87-4.88,其中质量性状的变异因素主要来源于叶色、叶缘形态、叶被绒毛、茎色和花色等性状;数量性状的变异因素主要来源于株高、分枝数、花轮数、花宽和花长等性状。聚类分析结果表明,栽培丹参和地面对照丹参亲缘关系较近,可聚在一起,其它丹参种质较为分散。3.丹参种质资源相关酶活及同工酶谱研究。对133份丹参种质资源过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)酶活的分析表明,SOD活性变异幅度最小,变异系数为12.4%;CAT活性变异幅度最大,变异系数达到45.3%。多样性分析表明,三者的多样性丰富,多样性指数均在4.5以上。利用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术对丹参种质资源的5种同工酶(POD、CAT、酯酶-EST、苹果酸脱氢酶-MDH、谷氨酸脱氢酶-GDH)进行了研究,共检测到30个同工酶位点,多态性位点数为25,多态性百分比为83.33%。基于5个同工酶标记的谱带数据进行聚类,可将丹参种质资源聚为7类。由此可见,本研究收集的丹参种质资源在酶活和同工酶谱表达上存在变异。4.丹参种质资源分子标记研究。利用ISSR和SRAP标记从DNA水平上对丹参种质资源进行了遗传多样性研究与评价,13个ISSR和6对SRAP引物分别扩增得到190条和251条带,平均多态性条带数为13.6条和41.6条,多态性百分比为94.5%和92.3%,表明收集的丹参种质资源遗传多样性丰富。基于ISSR、SRAP和ISSR+SRAP的聚类分析结果显示,三者聚类结果类似,所有材料聚为两类,其中第I类含有115份丹参种质(S1-S115),在遗传相似性系数一定时,第I类中的53份不同形态丹参种质(S1-S53)和62份航天诱变SP3代丹参种质(S54-S115)各自聚为一类;第II类中的栽培丹参种质(C1-C6)和地面对照丹参种质(CK1-CK6)距离最近,随后和野生丹参种质(W1-W6)聚为一类。在遗传相似性系数一定时,所有材料可相互区分开来。5.丹参种质资源有效成分研究。利用高效液相色谱(HPLC)对丹参种质资源地上部分和根的有效成分进行了分析,结果表明丹参种质资源地上部分酚酸类成分含量丰富,不同种质间存在较大差异,变异系数范围为15.8(肉桂酸)-47.9%(迷迭香酸);根中酚酸类成分和丹参酮类成分含量丰富,不同种质间差异显著,变异系数范围为24.7(丹参素)-67.1%(隐丹参酮)。说明有效成分在丹参种质资源间存在差异,此种差异是影响丹参药材品质的主要因素,可为进一步筛选丹参优良种质提供依据。6.丹参种质资源抗氧化活性评价研究。为了系统揭示丹参种质资源的抗氧化活性差异,以133份丹参种质资源地上部分和根为研究材料,对其总酚、总黄酮含量进行了测定,随后利用DPPH、ABTS、FRAP和CUPRAC法对其抗氧化活性进行了系统研究与评价。结果表明,丹参种质资源地上部分和根中总酚、总黄酮含量较高,具有极强的抗氧化活性,不同种质间变异较大,变异系数范围为24.1-40.0%。说明丹参种质资源地上部分和根均具有极强的抗氧化活性,抗氧化活性因种质不同而存在差异。7.丹参不同野生居群的遗传多样性研究。利用两种单引物扩增分子标记技术ISSR和SCo T对我国丹参主要分布区的9个野生居群进行了遗传多样性和群体结构分析。13个ISSR引物和20个SCo T引物分别扩增出182条和276条带,多态性百分比为85.14%和90.11%,表明野生丹参种质资源的遗传多样性丰富。根据遗传多样性分化系数GST可知,野生丹参种质资源在居群间和居群内均存在显著的遗传变异。综合两种标记进行遗传多样性分析,9个居群中山西运城居群的遗传多样性最高,山东日照居群最低。聚类分析结果表明,山西运城和陕西商洛居群的亲缘关系最近,而瑞金和其它8个居群的亲缘关系较远。经Mantel检验表明,丹参不同野生居群间的遗传距离和地理距离之间不存在相关性。个ISSR引物和20个SCo T引物分别扩增出182条和276条带,多态性百分比为85.14%和90.11%,表明野生丹参种质资源的遗传多样性丰富。根据遗传多样性分化系数GST可知,野生丹参种质资源在居群间和居群内均存在显著的遗传变异。综合两种标记进行遗传多样性分析,9个居群中山西运城居群的遗传多样性最高,山东日照居群最低。聚类分析结果表明,山西运城和陕西商洛居群的亲缘关系最近,而瑞金和其它8个居群的亲缘关系较远。经Mantel检验表明,丹参不同野生居群间的遗传距离和地理距离之间不存在相关性。8.经过系统研究与评价,本文收集的丹参种质资源遗传多样性丰富,所选评价指标能够有效区分种源差异。栽培丹参、野生丹参及地面对照丹参三个较稳定群体内的种质材料在生物学性状、生理生化水平、分子标记、有效成分和抗氧化活性方面均表达出一定程度的稳定性,而不同形态和航天诱变SP3代丹参种质变异幅度较大。基于分子标记和有效成分的聚类分析结果比较发现二者间存在较大的相似性,推测丹参种质资源的有效成分与遗传相关。基于生物学性状和其它指标间的相关性分析结果表明,丹参的生物学性状和其生理活性、有效成分及抗氧化活性间存在相关性,可为丹参优良品种选育提供理论依据。
【关键词】：丹参 种质资源 航天诱变 遗传多样性 分子标记
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.53
【目录】：

• 第一章 文献综述18-38
• 1.1 丹参的本草考证18-21
• 1.1.1 药用历史与命名18
• 1.1.2 资源分布18-19
• 1.1.3 丹参植物形态特征与鉴别19-20
• 1.1.4 丹参的功效与应用20-21
• 1.2 丹参化学成分研究进展21-23
• 1.2.1 脂溶性成分22
• 1.2.2 水溶性成分22-23
• 1.3 丹参药理作用研究进展23-27
• 1.3.1 对血液循环的影响23-24
• 1.3.2 改善微循环24
• 1.3.3 对心脏的影响24-25
• 1.3.4 抑制中枢神经系统，，保护大脑局部缺血25
• 1.3.5 对消化系统的影响25-26
• 1.3.6 抗炎及对免疫系统的作用26
• 1.3.7 抗肿瘤作用26
• 1.3.8 其它作用26-27
• 1.4 种质资源库的构建与评价27-32
• 1.4.1 自然变异27-28
• 1.4.2 航天诱变28-32
• 1.5 药用植物遗传多样性研究32-35
• 1.5.1 形态学标记32-33
• 1.5.2 同工酶标记33-34
• 1.5.3 次生代谢成分标记34
• 1.5.4 分子标记34-35
• 1.6 本研究目的和意义35-36
• 1.7 本研究的创新点36-37
• 1.8 本研究的技术路线37-38
• 1.8.1 丹参种质资源库的构建37
• 1.8.2 丹参种质资源遗传多样性研究37-38
• 第二章 航天诱变对SP2代丹参种质根产量和有效成分含量的影响研究38-50
• 2.1 引言38
• 2.2 材料、试剂与仪器38-39
• 2.2.1 材料和航天处理38-39
• 2.2.2 种植条件39
• 2.2.3 供试材料39
• 2.2.4 主要试剂39
• 2.2.5 主要仪器39
• 2.3 实验方法39-40
• 2.3.1 根产量分析39
• 2.3.2 有效成分分析39-40
• 2.3.3 数据处理40
• 2.4 结果与分析40-47
• 2.4.1 精密度实验40-41
• 2.4.2 重现性实验41
• 2.4.3 稳定性实验41
• 2.4.4 回收率实验41
• 2.4.5 标准曲线绘制41-42
• 2.4.6 SP2代丹参根产量分析42-43
• 2.4.7 SP2代丹参根有效成分分析43-45
• 2.4.8 主成分分析45-46
• 2.4.9 相关性分析46-47
• 2.5 讨论47-50
• 2.5.1 航天诱变对SP2代丹参根产量影响显著47-48
• 2.5.2 航天诱变对SP2代丹参有效成分影响显著48
• 2.5.3 主成分分析48-49
• 2.5.4 相关性分析49-50
• 第三章 丹参种质资源生物学性状遗传多样性研究50-67
• 3.1 引言50
• 3.2 材料与仪器50-51
• 3.2.1 丹参种质资源收集50-51
• 3.2.2 丹参种质资源库材料的确定与种植51
• 3.2.3 试验地概况51
• 3.3 实验方法51-53
• 3.3.1 质量性状研究51
• 3.3.2 数量性状研究51-53
• 3.3.3 数据处理53
• 3.4 结果与分析53-65
• 3.4.1 丹参种质资源库的构建53
• 3.4.2 丹参种质资源生物学性状分析53-55
• 3.4.3 主成分分析55-59
• 3.4.4 相关性分析59-60
• 3.4.5 聚类分析60-65
• 3.5 讨论65-67
• 3.5.1 丹参种质资源地上部分生物学性状变异65
• 3.5.2 丹参种质资源地上部分生物学性状相关性65
• 3.5.3 丹参种质资源地上部分生物学性状多样性及聚类分析65-67
• 第四章 丹参种质资源相关酶活及同工酶遗传多样性研究67-81
• 4.1 引言67
• 4.2 材料、试剂与仪器67-69
• 4.2.1 实验材料67
• 4.2.2 主要仪器67-68
• 4.2.3 主要试剂68
• 4.2.4 贮备液68-69
• 4.3 实验方法69-72
• 4.3.1 POD、SOD和CAT酶活测定69-70
• 4.3.2 同工酶谱研究70-72
• 4.3.3 数据处理72
• 4.4 结果与分析72-79
• 4.4.1 丹参种质资源相关酶活性研究72-74
• 4.4.2 丹参种质资源同工酶谱研究74-76
• 4.4.3 同工酶标记遗传多样性分析76-77
• 4.4.4 聚类分析77-79
• 4.5 讨论79-81
• 4.5.1 POD、SOD和CAT活性研究79
• 4.5.2 同工酶谱研究79
• 4.5.3 丹参种质资源遗传多样性与聚类分析79-81
• 第五章 基于ISSR和SRAP分子标记技术的丹参种质资源遗传多样性研究81-94
• 5.1 引言81-82
• 5.2 材料、试剂与仪器82
• 5.2.1 材料82
• 5.2.2 主要仪器设备82
• 5.2.3 主要实验试剂82
• 5.3 实验方法82-84
• 5.3.1 丹参基因组DNA的提取82
• 5.3.2 丹参基因组DNA的检测82-83
• 5.3.3 ISSR和SRAP标记分析方法83-84
• 5.3.4 数据处理84
• 5.4 结果与分析84-92
• 5.4.1 丹参种质资源的ISSR分析84-85
• 5.4.2 丹参种质资源的SRAP分析85-86
• 5.4.3 丹参种质资源遗传多样性分析86-87
• 5.4.4 聚类分析87-92
• 5.5 讨论92-94
• 5.5.1 ISSR与SRAP的比较92
• 5.5.2 种内的遗传变异92
• 5.5.3 遗传多样性分析92-94
• 第六章 丹参种质资源有效成分研究94-113
• 6.1 引言94
• 6.2 材料、仪器与试剂94
• 6.2.1 材料94
• 6.2.2 主要试剂94
• 6.3 实验方法94-95
• 6.3.1 样品制备94
• 6.3.2 HPLC分析94-95
• 6.3.3 数据处理95
• 6.4 结果与分析95-110
• 6.4.1 丹参种质资源地上部分酚酸类成分研究95-98
• 6.4.2 丹参种质资源根酚酸类成分研究98-99
• 6.4.3 丹参种质资源根丹参酮类成分研究99-103
• 6.4.4 主成分分析103-106
• 6.4.5 相关性分析106-108
• 6.4.6 聚类分析108-110
• 6.5 讨论110-113
• 6.5.1 丹参种质资源地上部分酚酸类成分研究110-111
• 6.5.2 丹参种质资源根酚酸类和丹参酮类成分研究111
• 6.5.3 丹参种质资源聚类分析111-113
• 第七章 丹参种质资源抗氧化活性研究113-136
• 7.1 引言113
• 7.2 材料、试剂与仪器113-114
• 7.2.1 材料113
• 7.2.2 主要试剂113
• 7.2.3 主要仪器113-114
• 7.3 实验方法114-116
• 7.3.1 供试液制备114
• 7.3.2 总酚含量测定114
• 7.3.3 总黄酮含量测定114-115
• 7.3.4 抗氧化活性研究115-116
• 7.3.5 数据处理116
• 7.4 结果与分析116-133
• 7.4.1 丹参种质资源总酚含量测定116-117
• 7.4.2 丹参种质资源总黄酮含量测定117-118
• 7.4.3 丹参种质资源地上部分抗氧化活性研究118-125
• 7.4.4 丹参种质资源根抗氧化活性研究125-129
• 7.4.5 主成分分析129
• 7.4.6 相关性分析129-131
• 7.4.7 聚类分析131-133
• 7.5 讨论133-136
• 7.5.1 丹参种质资源地上部分和根的总酚、总黄酮研究133
• 7.5.2 丹参种质资源地上部分和根的抗氧化活性研究133-134
• 7.5.3 相关性分析134
• 7.5.4 聚类分析134-136
• 第八章 基于两种SPAR分子标记技术的丹参野生种质资源遗传多样性分析136-155
• 8.1 引言136
• 8.2 材料、试剂与仪器136-138
• 8.2.1 材料136-137
• 8.2.2 主要仪器设备137
• 8.2.3 主要实验试剂137-138
• 8.3 实验方法138-139
• 8.3.1 丹参基因组DNA的提取138
• 8.3.2 丹参基因组DNA的检测138
• 8.3.3 ScoT、ISSR分子标记分析方法138
• 8.3.4 数据处理138-139
• 8.4 结果与分析139-152
• 8.4.1 SCoT分析139-140
• 8.4.2 ISSR分析140-141
• 8.4.3 ISSR+SCoT分析141-142
• 8.4.4 遗传多样性分析142-145
• 8.4.5 遗传相似系数和遗传距离计算145-146
• 8.4.6 聚类分析146-152
• 8.5 讨论152-155
• 8.5.1 SCoT与ISSR引物扩增结果比较152-153
• 8.5.2 各野生居群遗传多样性比较153
• 8.5.3 聚类分析153-155
• 第九章 总讨论与结论155-163
• 9.1 总讨论155-160
• 9.1.1 航天诱变对SP2代丹参种质的影响155-156
• 9.1.2 丹参种质资源库的构建156
• 9.1.3 丹参种质资源遗传多样性分析156-158
• 9.1.4 丹参种质资源生物学性状与有效成分等相关性及通径分析158-160
• 9.1.5 丹参种质资源改良和保护策略160
• 9.2 总结论160-163
• 参考文献163-182
• 附录1缩写表182-183
• 附录2丹参种质资源照片183-186
• 致谢186-187
• 作者简介187

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本文编号：689910