miR156在光叶百脉根中的功能研究及百脉根转录组深度测序分析

发布时间：2017-08-19 10:40

  本文关键词：miR156在光叶百脉根中的功能研究及百脉根转录组深度测序分析

  更多相关文章： miR156 SPL Lotus japonicus L.corniculatus 过表达 根瘤菌共生 转录组 数字基因表达谱 类黄酮代谢

【摘要】：百脉根(Lotus corniculatus L.,简写Lotus corniculatus)是豆科(Leguminosae)百脉根属(Lotus)多年生草本植物,广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲和大洋洲等地。由于茎叶柔软,细嫩多汁,适口性好,产草量高,耐牧性好,所以百脉根已成为目前世界上最优良的牧草之一。次生代谢产物黄酮类化合物和类胡萝卜素是影响百脉根牧草质量的两大类关键物质。有研究表明,植物界中保守的miR156家族既可以调控植物器官中黄酮类物质和类胡萝卜素的含量,又具有影响地上茎分支多少、增加植株生物量、延迟开花等作用。目前虽然在不同植物中对miR156的功能展开了大量研究,但对其自身的调控机制还不是十分清楚。本工作首先从模式物种光叶百脉根(Lotus corniculatus L. var. japonicus Regel,简写Lotus japonicus)中克隆了百脉根miR156前体基因,并通过在光叶百脉根中过表达该基因验证了miR156的真实性及其功能。进一步通过生物信息学方法鉴定了多条miR156靶标基因,初步阐明了百脉根属植物中可能存在的miR156调控网络。同时,借助第二代高通量测序技术对百脉根的转录组和基因表达谱进行了分析,发现了多个与黄酮类物质合成途径相关的关键酶和转录因子基因。本研究为阐明miR156及其靶基因构成的调控网络提供了新的证据,也为利用miR156对靶标基因表达的调节作用提升百脉根中黄酮类物质和类胡萝卜素的含量及牧草产量打下了基础。具体研究结果如下；1.根据拟南芥Pre-AtmiR156前体序列从光叶百脉根基因组中克隆了一条Pri-LjmiR156a前体序列。通过农杆菌介导的遗传转化方法,获得了两个独立的miR156过表达株系。表型和生化分析结果显示,转基因植株的生物量明显 增加,开花受到抑制,类黄酮代谢产物的分布也发生了改变。由于转基因植株的开花时间明显推迟,导致不能产生足够数量的种子。另外,个体与根瘤菌的共生作用也受到影响。相较于野生型植株,过表达植株只能生成50%左右的根瘤。2.利用生物信息学方法在光叶百脉根基因组中确定了多个miR156靶标基因,其中包括多条SPL家族基因。这些SPL基因的活性在miR156过表达植株中受到了选择性的抑制。通过改进的5'-RACE (Rapid amplification of cDNA ends)方法,证实LjmiR156能够识别TC70253、AU089181和TC57859等三个预测的靶标基因,并导致其信使RNA在百脉根中被剪切。通过检测植物与根瘤菌共生作用中关键基因的表达水平,发现在根瘤菌接种初期ENOD40-1、ENOD40-2、POLLUX和CYCLOPS等多个蛋白质编码基因受到miR156的抑制。3.为了在牧草中进一步研究miR156的调控作用,本工作借助高通量测序技术获得了大量的百脉根遗传信息。通过对百脉根进行转录组测序,得到了45,698条unigene,发现了150条与黄酮类化合物积累有关的unigene,覆盖了整个已知的黄酮类化合物生物合成途径。对豆科植物转录因子数据库进行搜索比对,发现2,998条百脉根unigene含有转录因子特征区域。其中unigene322、C12952.Contigl-2、Unigene19239和Unigene2664分别为拟南芥黄酮类合成调控转录因子编码基因TTG1、PAP1, PAP2和TT2的同源基因,它们之间具有很高的相似性。4.通过数字基因表达谱分析百脉根黄酮类合成相关基因在花、果荚、叶和根等不同器官中的表达模式,发现关键酶编码基因和相关的转录因子基因在所测定的四种器官中表达水平不尽相同。WD40家族同源基因unigene322在四种器官中都能够表达；ANR家族的unigene更倾向于在花、果荚及根中表达,在叶片中表达量很低；ANS家族基因更倾向于在花、根和叶中表达。
【关键词】：miR156 SPL Lotus japonicus L.corniculatus 过表达 根瘤菌共生 转录组 数字基因表达谱 类黄酮代谢
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S541.6;Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写7-12
• 第一章 引言12-31
• 1.1 Small RNA的研究进展12
• 1.2 sRNA的发现及分类12-14
• 1.3 miRNA的生物发生过程及研究进展14-17
• 1.4 miRNA在植物中的功能研究17-19
• 1.4.1 miRNA参与植物激素信号通路的调节17-18
• 1.4.2 miRNA在植物器官发育形成中的作用18-19
• 1.4.3 miRNA在植物中的其他生物学功能19
• 1.5 miR156及其靶基因SPL的功能研究进展19-23
• 1.6 百脉根在生物学中的研究意义23-25
• 1.7 百脉根与根瘤菌共生的分子调控机制25-26
• 1.8 第二代测序技术26-27
• 1.9 植物体内黄酮类化合物生物合成的研究及其意义27-29
• 1.10 本研究的目的、内容和意义29-31
• 第二章 miR156在光叶百脉根中的功能研究31-73
• 2.1 材料和主要试剂31-33
• 2.1.1 植物材料31
• 2.1.2 宿主菌和质粒载体31
• 2.1.3 主要试剂和溶液的配制31-33
• 2.1.4 主要仪器33
• 2.2 载体构建和遗传转化33-51
• 2.2.1 LjmiR156α的分子克隆33-38
• 2.2.1.1 RNA的提取33-35
• 2.2.1.2 cDNA第一链的合成35
• 2.2.1.3 利用PCR克隆目标基因35
• 2.2.1.4 PCR产物的回收35-36
• 2.2.1.5 回收片段与克隆载体的连接36-37
• 2.2.1.6 感受态细胞的制备及重组质粒对大肠杆菌的转化37-38
• 2.2.2 过表达载体的构建38
• 2.2.3 含有过表达载体的农杆菌的获得38-39
• 2.2.3.1 农杆菌感受态细胞的制备38-39
• 2.2.3.2 农杆菌的电转化39
• 2.2.4 光叶百脉根的遗传转化39-41
• 2.2.5 转基因光叶百脉根的筛选与鉴定41-45
• 2.2.5.1 转基因植株的PCR鉴定41-42
• 2.2.5.2 转基因株系的Southern印迹分析42-45
• 2.2.6 LjmiR156靶基因的筛选及鉴定45-48
• 2.2.6.1 LjmiR156靶基因的生物信息学筛选45-46
• 2.2.6.2 LjmiR156靶基因切割位点的验证46-48
• 2.2.7 基因表达量的检测48
• 2.2.8 原花青素的组织化学染色48
• 2.2.9 光叶百脉根与根瘤菌的共生48-50
• 2.2.10 根瘤发生相关基因的表达分析50-51
• 2.2.11 统计学分析51
• 2.3 结果与分析51-68
• 2.3.1 LjmiR156a的分子克隆及在光叶百脉根中的过表达51-54
• 2.3.2 过表达载体的构建54-56
• 2.3.3 miR156过表达光叶百脉根的获得56-57
• 2.3.4 miR156过表达光叶百脉根株系的Southern杂交验证57-59
• 2.3.5 miR156过表达植株的表型特征59-61
• 2.3.6 光叶百脉根miR156靶基因的预测及检验61-65
• 2.3.6.1 光叶百脉根miR156潜在靶基因的预测分析61-62
• 2.3.6.2 Lj-miR156对靶基因的调控作用62-65
• 2.3.7 过表达miR156对光叶百脉根与根瘤菌共生的影响65-67
• 2.3.8 miR156可以影响黄酮类化合物的分布67-68
• 2.4 讨论68-73
• 第三章 百脉根转录组及表达谱的测定73-87
• 3.1 实验材料与方法73-76
• 3.1.1 实验材料73
• 3.1.2 RNA的提取73
• 3.1.3 转录组测定73-74
• 3.1.4 数据分析74-76
• 3.2 百脉根转录组的分析76-84
• 3.2.1 测序结果分析76-77
• 3.2.2 百脉根转录组与光叶百脉根基因组的比较77-78
• 3.2.3 对拼接序列进行基因功能注释78-79
• 3.2.4 类黄酮合成代谢途径相关基因79-83
• 3.2.5 百脉根转录组中的转录因子83-84
• 3.3 各器官基因的数字表达谱分析84-86
• 3.4 讨论86-87
• 结论87-88
• 附录88-91
• 附表1 论文中所使用的引物88-91
• 参考文献91-102
• 攻读博士学位期间取得的学术成果102-103
• 个人简介103-104
• 致谢104

，

本文编号：700269