茉莉酸信号途径参与调控沉香倍半萜生物合成的分子机制研究

发布时间：2017-08-22 17:13

  本文关键词：茉莉酸信号途径参与调控沉香倍半萜生物合成的分子机制研究

  更多相关文章： 白木香 沉香 倍半萜 JA信号途径 调控机制

【摘要】：茉莉酸(JA)及其衍生物统称为茉莉素(JAs),广泛存在于植物中的一类植物内源激素,对植物生长和发育具有广泛的生理效应；同时可作为内源信号分子参与植物的抗逆反应。长期以来,对JA信号途径的机制及功能的研究一直是生命科学研究的热点之一。白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)为瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)常绿乔木,是我国生产传统名贵中药材沉香的基原植物,同时也是中药沉香的正品来源。作为传统中药,沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效。白木香只有在受到伤害时才能形成沉香,我们已证明了沉香是白木香防御反应的产物。沉香主要由倍半萜类和苯乙基色酮类衍生物两种类型的化合物组成。其中,倍半萜类化合物的生物合成途径研究相对比较清晰,但对于它的调控途径不清楚。前期研究中发现,外源茉莉酸甲酯(MeJA)能显著诱导白木香树和愈伤组织中沉香倍半萜物质的合成与积累。这些结果表明,JA与沉香倍半萜的形成有关；但它是否直接参与调控以及如何调控沉香倍半萜的生物合成还不清楚。本文从分子层面上研究JA信号途径与沉香倍半萜形成的关系,为揭示白木香结香机理提供基础数据。本研究获得了以下主要结果：1、JA信号分子能调控沉香倍半萜的合成。结合白木香转录组基因表达谱数据与荧光定量PCR (qRT-PCR)检测分析,发现JA信号途径中的关键基因显著响应外界胁迫,且均属于响应早期伤害的基因。热激处理能诱导白木香悬浮细胞中内源激素JA和沉香倍半萜(a-愈创木烯,α-蛇麻烯和δ-愈创木烯)的快速大量合成；JA合成抑制剂能抑制JA和倍半萜的合成,在热处理后12h以内未检测到沉香倍半萜成分,24 h后才检测到少量倍半萜生成。2、首次从白木香中,也是沉香属植物中分离并克隆了JA信号途径中的5个关键基因(LOX、CPI1、NINJA、JAZ和MYC2) 的 cDNA全长序列。分别命名为,AsLOX1、AsCOI1、AsNINJA1、AsJAZ1和AsMYC2,为倍半萜合成过程中JA信号途径的研究奠定基础。3、基本明确了白木香AsJAZ1基因功能,过表达AsJAZ1基因能抑制拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPSll的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的负调控因子之一。通过亚细胞定位分析,AsJAZ1基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以叶中的表达量最高。将白木香AsJAZ1基因转入野生型拟南芥中,该基因过表达抑制了拟南芥中TPS21和TPS11基因的表达。4、基本明确了白木香AsMYC2基因功能,AsMYC2基因过表达能正调控拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的正调控转录因子。亚细胞定位分析表明,AsMYC2基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以茎和根中的表达量最高；AsMYC2基因过表达能正调控野生型拟南芥倍半萜合酶基因：VPS21和TPS11的表达；在拟南芥myc2-2突变体中,AsMYC2基因过表达能一定程度上恢复对TPS21和TPS11基因表达的调控作用。5.明确了白木香AsJAZ1与AsMYC2白间存在体外相互作用。通过基因重组技术,成功的构建了AsJAZl基因和AsMYC2基因的原核表达载体,在大肠杆菌中成功的诱导了His-AsJAZ1(?)GST-AsMYC2融合蛋白的表达,并进行了蛋白纯化,高质量蛋白的获得为今后蛋白多克隆抗体的制备提供材料基础。利用pull-down技术验证了两蛋白间相互作用,为研究JA信号途径参与调控沉香倍半萜的生物合成机制奠定基础。通过研究基本证实了JA信号途径参与沉香倍半萜生物合成的调控过程。本研究也是首次在沉香属植物中,针对沉香倍半萜生物合成调控机制上开展的关于JA信号分子通路较系统的研究,将对其它信号分子通路的研究有参考价值,为全面解析伤害诱导白木香防御反应形成沉香的调控机制提供分子依据。
【关键词】：白木香 沉香 倍半萜 JA信号途径 调控机制
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.19
【目录】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 缩略词表15-17
• 文献综述17-27
• 1 植物防御反应的研究进展17-18
• 2 茉莉酸在植物伤信号传递中的作用18-22
• 2.1 茉莉酸信号的感知18
• 2.2 茉莉酸类化合物的合成18-19
• 2.3 植物伤信号茉莉酸的传递19-21
• 2.4 茉莉酸信号分子与其他信号分子在转导过程中的交叉作用21-22
• 3 JA在伤害胁迫下对植物次生代谢物合成的调控作用22-24
• 3.1 尼古丁23
• 3.2 长春花碱23
• 3.3 青蒿素23
• 3.4 硫代葡萄糖甙/亚麻荠素23
• 3.5 花青素23-24
• 3.6 苄基异喹啉生物碱24
• 4 沉香的研究进展24-27
• 4.1 沉香形成的机理24-25
• 4.2 沉香的化学成分25
• 4.3 沉香的结香方法25-27
• 前言27-39
• 技术路线图28-29
• 参考文献29-39
• 第一章 茉莉酸信号分子与沉香倍半萜形成的相关性研究39-57
• 1 实验材料39-40
• 1.1 试剂39
• 1.2 仪器39-40
• 1.3 植物材料40
• 1.4 实验所用引物的设计与合成40
• 2 实验方法40-44
• 2.1 实验材料处理40-41
• 2.2 内源茉莉酸的测定41-42
• 2.3 倍半萜的测定42
• 2.4 茉莉酸信号通路中核心基因的表达分析42-44
• 2.4.1 总RNA的提取42-43
• 2.4.2 DNase Ⅰ消化总RNA43
• 2.4.3 cDNA第一链的合成43-44
• 2.4.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)44
• 3 实验结果44-53
• 3.1 基于转录组学茉莉酸信号通路中核心基因的表达谱44-46
• 3.2 热激处理对白木香悬浮细胞中内源茉莉酸含量的影响46-48
• 3.3 热激处理对白木香悬浮细胞中倍半萜含量的影响48-49
• 3.4 伤害胁迫下茉莉酸信号通路中核心基因的表达49-53
• 4 讨论53-54
• 5 本章小结54
• 参考文献54-57
• 第二章 茉莉酸信号通路中关键基因全长cDNA克隆与生物信息学分析57-81
• 1 实验材料57-58
• 1.1 试剂57-58
• 1.2 仪器58
• 1.3 材料58
• 1.3.1 植物材料58
• 1.3.2 菌株与载体58
• 1.4 实验所用引物的设计与合成58
• 2 实验方法58-64
• 2.1 总RNA的提取58
• 2.2 mRNA的分离与纯化58-60
• 2.3 5'和3'cDNA第一链的合成60-61
• 2.3.1 5'cDNA第一链的合成60
• 2.3.2 3'cDNA第一链的合成60-61
• 2.4 cDNA第一链的合成61
• 2.5 基因cDNA序列全长的克隆61-64
• 2.5.1 5'和3'cDNA的扩增61-62
• 2.5.2 PCR产物检测与回收62-63
• 2.5.3 连接、转化与测序63-64
• 2.6 生物信息学分析及进化树的构建64
• 3 结果与分析64-77
• 3.1 白木香总RNA的提取64
• 3.2 白木香JA信号通路中关键基因的克隆与生物信息学分析64-77
• 3.2.1 白木香AsLOX1基因64-67
• 3.2.2 白木香AsCOI1基因67-70
• 3.2.3 白木香AsNINJA1基因70-72
• 3.2.4 白木香AsJAZ1基因72-74
• 3.2.5 白木香AsMYC2基因74-77
• 4 讨论77-78
• 5 本章小结78
• 参考文献78-81
• 第三章 白木香AsJAZ1基因通过茉莉酸途径负调控拟南芥倍半萜合酶基因的表达81-99
• 1 实验材料81-83
• 1.1 试剂81
• 1.2 仪器81-82
• 1.3 材料82
• 1.3.1 植物材料82
• 1.3.2 菌株与载体82
• 1.4 实验所用引物的设计与合成82-83
• 2 实验方法83-91
• 2.1 实验材料处理83
• 2.2 总RNA的提取83
• 2.3 mRNA的分离与纯化83
• 2.4 cDNA第一链的合成83
• 2.5 实时荧光定量PCR83
• 2.6 白木香AsJAZ1基因瞬时表达分析83-86
• 2.6.1 瞬时表达载体的构建83-85
• 2.6.2 基因枪法转化祥葱表皮细胞85-86
• 2.7 白木香AsJAZ1基因转化拟南芥86-91
• 2.7.1 过表达载体的构建86-88
• 2.7.2 浸花法转化拟南芥88-89
• 2.7.3 转基因植株的筛选和鉴定89-91
• 2.7.4 qRT-PCR检测转基因拟南芥中倍半萜合酶基因的表达91
• 3 结果与分析91-96
• 3.1 白木香AsJAZ1基因的表达分析91-93
• 3.1.1 伤害胁迫下AsJAZ1基因的表达模式91-92
• 3.1.2 AsJAZ1基因组织表达92-93
• 3.2 白木香AsJAZ1基因表达的亚细胞定位93
• 3.3 白木香AsJAZ1基因的过表达对拟南芥倍半萜合酶基因表达的影响93-96
• 3.3.1 植物过表达载体的构建与鉴定93-94
• 3.3.2 转基因拟南芥植物的获得94-95
• 3.3.3 白木香AsJAZ1基因负调控拟南芥倍半萜合酶基因的表达95-96
• 4 讨论96-97
• 5 本章小结97
• 参考文化97-99
• 第四章 白木香AsMYC2基因通过茉莉酸途径正调控拟南芥倍半萜合酶基因表达99-111
• 1 实验材料99-100
• 1.1 主要试剂99
• 1.2 仪器99
• 1.3 材料99
• 1.3.1 植物材料99
• 1.3.2 菌株与载体99
• 1.4 实验所用引物的设计与合成99-100
• 2 实验方法100-102
• 2.1 实验材料处理100
• 2.2 总RNA的提取100
• 2.3 mRNA的分离与纯化100
• 2.4 cDNA第一链的合成100
• 2.5 实时荧光定量PCR100
• 2.6 白木香AsMYC2基因瞬时表达分析100-101
• 2.6.1 瞬时表达载体的构建100-101
• 2.6.2 基因枪法转化洋葱表皮细胞101
• 2.7 白木香AsMYC2基因转化拟南芥101-102
• 2.7.1 过表达载体的构建101-102
• 2.7.2 浸花法转化拟南芥102
• 2.7.3 转基因植株的筛选和鉴定102
• 2.7.4 qRT-PCR检测转基因拟南芥中倍半萜合酶基因的表达102
• 3 结果与分析102-107
• 3.1 白木香AsMYC2基因的表达分析102-104
• 3.1.1 伤害胁迫下AsMYC2基因的表达模式102-103
• 3.1.2 AsMYC2基因组织表达103-104
• 3.2 白木香AsMYC2基因表达的亚细胞定位104
• 3.3 白木香AsMYC2基因过表达对拟南芥倍半萜合酶基因表达的影响104-107
• 3.3.1 植物表达载体的构建与鉴定104-105
• 3.3.2 转基因拟南芥植物的获得105-106
• 3.3.3 白木香AsMYC2基因正调控拟南芥倍半萜合酶基因的表达106-107
• 4 讨论107-108
• 5 本章小结108-109
• 参考文献109-111
• 第五章 白木香AsJAZ1与AsMYC2蛋白相互作用研究111-127
• 1 材料与方法111-116
• 1.1 材料111-112
• 1.1.1 工具酶及主要试剂111-112
• 1.1.2 菌种及载体112
• 1.1.3 主要仪器112
• 1.1.4 实验所用引物的设计与合成112
• 1.2 实验方法112-116
• 1.2.1 白木香总RNA提取及cDNA的合成112
• 1.2.2 基因扩增112-113
• 1.2.3 原核表达载体的构建113
• 1.2.4 重组蛋白的原核表达113-114
• 1.2.5 表达条件的优化114
• 1.2.6 重组蛋白表达形式的鉴定114
• 1.2.7 重组蛋白的纯化114-115
• 1.2.8 Western blotting鉴定表达蛋白115
• 1.2.9 Pull-down鉴定白木香AsJAZ1与AsMYC2蛋白体外相互作用115-116
• 2 结果与分析116-123
• 2.1 原核表达载体的构建及鉴定116-118
• 2.1.1 AsMYC2基因原核表达载体的构建及鉴定116-117
• 2.1.2 AsJAZ1基因原核表达载体的构建及鉴定117-118
• 2.2 重组蛋白的诱导表达118-120
• 2.2.1 GST-AsMYC2融合蛋白的诱导表达118-119
• 2.2.2 His-AsJAZ1融合蛋白的诱导表达119-120
• 2.3 重组蛋白的诱导条件的优化120
• 2.4 重组蛋白的表达形式120-121
• 2.4.1 GST-AsMYC2融合蛋白的表达形式120-121
• 2.4.2 His-AsJAZ1融合蛋白的表达形式121
• 2.5 重组蛋白的纯化121-122
• 2.5.1 GST-AsMYC2融合蛋白的纯化121-122
• 2.5.2 His-AsJAZ1融合蛋白的纯化122
• 2.6 重组蛋白的鉴定122-123
• 2.7 AsJAZ1与AsMYC2蛋白体外相互作用分析123
• 3 讨论123-124
• 4 本章小结124-125
• 参考文献125-127
• 结语127-129
• 致谢129-131
• 作者简介131

【参考文献】

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