小麦及其近缘植物fast ω-醇溶蛋白基因的克隆及其对加工品质和致敏性的影响

发布时间：2017-08-22 19:37

  本文关键词：小麦及其近缘植物fast ω-醇溶蛋白基因的克隆及其对加工品质和致敏性的影响

  更多相关文章： 小麦 近缘植物 fastω-醇溶蛋白 IgE-binding抗原决定簇 小麦依赖-运动诱导的过敏反应 加工品质

【摘要】：小麦是重要的粮食作物,是居住在温带地区人们主要的食物来源。然而,小麦还是主要的食物过敏原之一,能够诱发多种食物免疫反应例如乳糜泻(Celiac Disease)、面包师哮喘(Baker's asthma)、小麦依赖-运动诱导的过敏反应(Wheat dependent-exercise induced anaphyxis,WDEIA)等。其中,WDEIA被认为是由小麦fastω-醇溶蛋白诱发的罕见却又严重的过敏反应。然而,目前对该蛋白质的研究较少。本研究从小麦及其近缘植物中利用同源克隆技术得到了fastω-醇溶蛋白的编码基因,并分析了它们的分子结构、致敏性机制以及对面团特性的影响,主要结果如下:1、在小麦及其近缘植物中,均存在fastω-醇溶蛋白的编码基因,这些基因编码的醇溶蛋白不同于已经大量报道过的ω-醇溶蛋白,它们的N端前三个氨基酸为SRL、TRQ、GRL、SRP、NRL或者SRM,同时,这些蛋白质的分子量大多小于已经报道过的ω-醇溶蛋白。这类储藏蛋白在分子结构上包括信号肽,N端,重复区和C端,其重复区的大小决定了蛋白质的大小。通过分析比较其蛋白质一级结构,发现在这些蛋白质中存在大量的Ig E-binding抗原决定簇,可能能够诱发小麦依赖-运动诱导的过敏反应。其中含量最高的Ig E-binding抗原决定簇序列为QQFPQQQ。2、利用原核表达以及蛋白质纯化,分别获得纯化的小麦的四类醇溶蛋白,即α-醇溶蛋白,γ-醇溶蛋白,slowω-醇溶蛋白和fastω-醇溶蛋白。将这四类醇溶蛋白分别以50mg,100mg和150mg的量掺入面粉中,利用揉混仪和质构仪分析它们对面团特性的影响。结果表明,100mg和150mgα-醇溶蛋白和50mg,100mg和150mgγ-醇溶蛋白能够对面团特性起到显著的影响,而两种ω-醇溶蛋白对面团特性的影响均较小。3、醇溶蛋白对小鼠进行腹腔注射分析其致敏性差异,结果表明,α-醇溶蛋白,γ-醇溶蛋白,slowω-醇溶蛋白和fastω-醇溶蛋白对小鼠的致敏后都能够产生高水平的Ig E,且Ig E浓度没有差异,说明这些蛋白质的致敏能力没有显著差异,而通过交互反应则发现,α-醇溶蛋白,γ-醇溶蛋白,slowω-醇溶蛋白同fastω-醇溶蛋白的特异性血清均能产生高水平的Ig E,而fastω-醇溶蛋白与α-醇溶蛋白,γ-醇溶蛋白,slowω-醇溶蛋白的特异性血清则无法产生高水平的Ig E,推测fastω-醇溶蛋白之所以被认为是主要的过敏原可能是由于在激发过敏的阶段,检测到的Ig E主要是fastω-醇溶蛋白特异性的Ig E造成的。4、进化分析结果表明,fastω-醇溶蛋白和slowω-醇溶蛋白分别处于两个不同的分支,它们的分歧时间为21.64 MYA,说明这两类ω-醇溶蛋白有着不同的进化路线。中性进化分析以及碱基同义替换/碱基非同义替换分析表明,fastω-醇溶蛋白基因的进化符合中性进化理论,同时有着纯化选择的趋势。
【关键词】：小麦 近缘植物 fastω-醇溶蛋白 IgE-binding抗原决定簇 小麦依赖-运动诱导的过敏反应 加工品质
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S512.1
【目录】：

• 符号说明5-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-25
• 1.1 乳糜泻11-18
• 1.1.1 诱发乳糜泻的因素12
• 1.1.2 乳糜泻的预防措施12-18
• 1.2 小麦依赖-运动诱导的过敏反应18-21
• 1.2.1 食物过敏的发病机制19-21
• 1.3 小麦及其近缘植物醇溶蛋白的研究进展21-25
• 1.3.1 小麦及其近缘植物醇溶蛋白的分类21-22
• 1.3.2 醇溶蛋白基因染色体定位22-23
• 1.3.3 醇溶蛋白氨基酸序列结构23-24
• 1.3.4 醇溶蛋白与面粉品质的关系24-25
• 2 材料与方法25-38
• 2.1 试验材料25-38
• 2.1.1 植物材料25-26
• 2.1.2 动物材料26
• 2.1.3 试验所用试剂盒、载体、酶及菌株26
• 2.1.4 试剂配制26-29
• 2.1.5 小麦及其近缘植物籽粒总RNA提取及反转录29-30
• 2.1.6 小麦及其近缘植物fast ω-醇溶蛋白编码基因克隆30-32
• 2.1.7 序列分析32
• 2.1.8 半定量PCR32-33
• 2.1.9 原核表达载体构建33-37
• 2.1.10 抗原制备37
• 2.1.11 小鼠免疫37
• 2.1.12 质构仪测定面团延展性37-38
• 3 结果分析38-57
• 3.1 小麦及其近缘植物醇溶蛋白A-PAGE分析38-39
• 3.2 1BL/1RS易位系和非 1BL/1RS易位系小麦fast ω-醇溶蛋白编码基因的表达39-40
• 3.3 小麦及其近缘植物fast ω-醇溶蛋白编码基因扩增40-41
• 3.4 小麦及其近缘植物fast ω-醇溶蛋白编码基因序列分析41-47
• 3.5 IgE-binding抗原表位的数目分析47-49
• 3.6 进化分析49-51
• 3.6.1 Fast ω-醇溶蛋白同义替换/非同义替换分析49
• 3.6.2 Tajima′s D分析49-50
• 3.6.3 系统发育树及分歧时间分析50-51
• 3.7 原核表达及蛋白纯化51-52
• 3.8 不同醇溶蛋白组分对面团特性的影响52-55
• 3.9 ELISA分析血清总IgE含量55-57
• 4 讨论57-60
• 4.1 小麦及其近缘植物中fast ω-醇溶蛋白编码基因的变异及多态性57-58
• 4.2 小麦及其近缘植物中储藏蛋白的起源与进化58
• 4.3 醇溶蛋白对面粉加工品质的影响58-60
• 4.4 Fast ω-醇溶蛋白诱发速发性过敏反应的分子机制60
• 5 结论60-61
• 参考文献61-78
• 附录78-83
• 致谢83-84
• 攻读博士学位期间发表文84

【共引文献】

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本文编号：721060