抑制素A对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响

发布时间：2017-08-23 08:01

  本文关键词：抑制素A对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响

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【摘要】：抑制素（inhibin）是由雌性动物卵巢和雄性动物睾丸分泌的糖蛋白异二聚体，属于TGFβ超家族一员，α (INHA)和βA（INHβA）亚基构成抑制素A，α和βB (INHβB)形成抑制素B。在雌性动物体内，抑制素主要通过内分泌途径抑制垂体合成和分泌FSH，调节卵泡发育、配子发生和激素分泌。在卵巢局部，抑制素还可以通过自分泌和旁分泌作用调节卵母细胞-颗粒细胞同步发展。动物发情周期中，外周血液抑制素水平可以反应出卵巢上生长卵泡的数量，是决定动物卵泡发育和排卵的关键因素。目前关于抑制素对动物生殖影响的研究主要集中在利用抑制素进行动物免疫实验，而对细胞增殖、凋亡影响的研究则主要集中在生殖肿瘤细胞上。抑制素对不同动物或细胞的激素分泌影响不一致，对家畜卵母细胞成熟研究较少，尤其在猪的研究尚未见报道。本研究以成年猪卵巢为材料，以卵泡颗粒细胞和卵母细胞为研究对象，进行卵泡颗粒细胞体外培养、卵母细胞体外成熟、孤雌激活和早期胚胎发育等一系列实验，探讨抑制素A对猪卵泡颗粒细胞类固醇激素合成、颗粒细胞增殖、凋亡、卵母细胞成熟的影响，另外还研究抑制素α亚基基因多态性与猪卵泡囊肿之间的联系。研究内容主要有以下几个方面： 1.抑制素A对卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 本研究分离猪卵泡颗粒细胞，利用FSHR进行免疫荧光实验对分离的细胞进行鉴定。免疫荧光结果显示：分离得卵泡颗粒细胞纯度在90%以上，满足后续实验要求。然后分别使用不同浓度（0、10、100、200ng/mL）的人源重组抑制素A和400ng/mL的抑制素α抗体处理体外培养的猪卵泡颗粒细胞，处理时间分为4个梯度，即12、24、48和72h。处理结束后提取RNA进行荧光定量。荧光定量结果显示，200ng/mL的抑制素A处理颗粒细胞48h，显著增加了颗粒细胞内FSHR、LHR、CYP11a1和STAR基因mRNA的表达(p0.05)。ELISA方法检测细胞培养上清中孕酮和雌二醇的浓度，结果显示，200ng/mL抑制素A作用48h显著提高了颗粒细胞中雌二醇的合成及分泌（p0.05）。200ng/mL抑制素A处理颗粒细胞24h-48h可以显著抑制孕酮的分泌(p0.05)，72h则表现为促进作用（p0.05）。 2.抑制素A对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响 为了研究抑制素A对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响，在猪卵泡颗粒细胞体外培养过程中添加不同浓度（0、20、50、100ng/mL）的人源重组抑制素A处理颗粒细胞24h，MTS检测细胞活力，结果显示：高浓度（50、100ng/mL）的抑制素A可以显著提高颗粒细胞活力(p0.05)，并且呈剂量依赖效应。利用JC-1方法检测线粒体膜电位，发现100ng/mL抑制素A处理48h可以显著提高线粒体膜电位。之后，我们研究了抑制素A对颗粒细胞增殖、凋亡基因表达影响，分别利用不同浓度（0、10、100、200ng/mL）的抑制素A处理颗粒细胞12、24、48、72h，提取RNA后进行荧光定量。结果显示：抑制素A处理48h可以促进增殖基因PCNA、CCNB1的表达，抑制凋亡基因Caspase-3表达（p0.05），并且呈剂量依赖效应。细胞周期检测发现，与对照组比较，200ng/mL的抑制素A处理48h可以显著提高S期细胞比例（p0.05）。利用RNA干扰方法沉默颗粒细胞内抑制素α亚基基因表达，细胞内Caspase-3基因的表达量升高，，而细胞周期蛋白CCNB1基因表达量则降低（p0.05）。这些结果说明抑制素A可以促进颗粒细胞增殖，抑制其凋亡。 3.抑制素A对卵母细胞体外成熟的影响 为了研究抑制素A对猪卵母细胞体外成熟的影响，在卵母细胞体外成熟培养液中添加200ng/mL的抑制素A，结果发现，与对照组相比，抑制素A可以促进GV期GDF9、COX2基因的表达（p0.05），并能够促进卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟。体外成熟液或胚胎发育液中添加抑制素A，可以提高猪卵母细胞孤雌激活胚胎的卵裂率（p0.05）,但是对囊胚率影响不显著（p0.05）。 4.抑制素α亚基基因多态性与猪卵泡囊肿之间的联系 利用PCR-SSCP与PCR-RFLP方法，检测患有卵泡囊肿母猪和正常母猪抑制素α亚基基因c.-42GA和c.3222GA位点基因多态性与卵泡囊肿之间的联系。结果显示c.-42GA和c.3222GA多态性与卵泡囊肿存在联系（p0.05），c.-42GG和c.3222GG基因型母猪患囊肿的风险较低。同时ELISA结果显示囊肿卵泡液中含有高浓度的抑制素A。 综上所述，本实验证明抑制素A能够促进体外培养的猪卵泡颗粒细胞类固醇激素合成分泌，促进颗粒细胞增殖。抑制素A还可以促进卵母细胞体外成熟，促进孤雌激活胚胎的卵裂，但是对早期胚胎发育的囊胚率影响不显著。另外抑制素α亚基与猪卵泡囊肿存在联系。
【关键词】：抑制素A 卵泡颗粒细胞 增殖 卵母细胞成熟
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文对照表12-14
• 前言14-16
• 第一篇 文献综述16-30
• 第一章 抑制素分子结构及作用机理16-22
• 1.1 抑制素的发现16
• 1.2 抑制素分子结构16
• 1.3 抑制素在体内分布16-17
• 1.4 抑制素表达调控17-19
• 1.5 抑制素作用机理19-20
• 1.6 影响抑制素作用的因素20-22
• 第二章 抑制素与雌性动物生殖生理22-30
• 2.1 抑制素对卵泡发育影响22-24
• 2.2 抑制素对排卵影响24
• 2.3 抑制素与黄体形成和消融24-25
• 2.4 抑制素与卵母细胞成熟25-26
• 2.5 抑制素与妊娠26
• 2.6 抑制素与激素分泌26-28
• 2.7 抑制素与乳腺上皮28
• 2.8 抑制素与生殖系统疾病28-29
• 2.9 抑制素在雌性动物生产中应用29-30
• 第二篇 研究内容30-92
• 第一章 抑制素 A 对猪卵泡颗粒细胞类固醇激素分泌的影响30-48
• 1.1 材料30-32
• 1.2 方法32-39
• 1.3 实验结果39-45
• 1.4 讨论45-47
• 1.5 小结47-48
• 第二章 抑制素 A 对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响48-70
• 2.1 材料48-49
• 2.2 方法49-57
• 2.3 结果57-66
• 2.4 讨论66-68
• 2.5 小结68-70
• 第三章 抑制素 A 对猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响70-82
• 3.1 材料70-71
• 3.2 方法71-75
• 3.3 结果75-78
• 3.4 讨论78-80
• 3.5 小结80-82
• 第四章 抑制素α亚基基因多态性与母猪卵泡囊肿的研究82-92
• 4.1 材料82-83
• 4.2 方法83-85
• 4.3 结果分析85-89
• 4.4 讨论89-90
• 4.5 小结90-92
• 结论92-94
• 参考文献94-108
• 导师简介108-110
• 作者简介110-112
• 攻读学位期间发表论文及研究成果112-116
• 致谢116

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：723865