MiR-27a-3p对黑色素生成的作用及机制研究

发布时间：2017-08-26 12:13

  本文关键词：MiR-27a-3p对黑色素生成的作用及机制研究

  更多相关文章： miR-27a-3p Wnt3a 黑色素生成 Tyrp2启动子

【摘要】：哺乳动物毛色调控是一个由多基因调控的复杂的过程,主要由黑色素的合成和分布决定,而黑色素是由黑色素细胞中的黑素体合成的。Tyrp2是黑色素生成的关键酶酪氨酸酶蛋白家族的第3个成员,具有多巴色素异构酶(DT)的活性,催化多巴色素转变为5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA),加速黑色素生成的作用。相对于基因的调控研究,关于miRNAs对黑色素生成调控的研究较少。miRNAs通过转录后调控抑制靶基因的翻译,参与细胞发生、增殖、分化、凋亡和肿瘤转移等多个生物学过程,甚至黑色素生成。研究miRNAs的功能,关键是确定miRNAs的靶基因。目前,miRNAs靶基因的确定方法主要通过生物信息学软件预测和实验验证。为了确定miR-27a-3p对小鼠黑色素生成的影响及其作用机制、miR-27a-3p对绵羊黑色素生成的影响以及为后续转基因动物实验寻找黑色素细胞特异性启动子,本实验通过不同的生物信息学软件对小鼠miR-27a-3p靶基因进行预测,构建靶基因3’UTR双荧光报告载体和miR-27a-3p过表达载体；共转染HEK 293 T细胞验证miRNAs和靶基因的互作关系；并对不同毛色小鼠皮肤中miR-27a-3p及其靶基因Wnt3a的表达量进行检测。通过向小鼠黑色素细胞中转染miR-27a-3p mimic, inhibitor及其相应的NC,并检测转染后细胞中miR-27a-3p和Wnt3a mRNA表达量、Wnt3a蛋白表达量以及黑色素含量,从而进一步确定miR-27a-3p在黑色素生成中的功能。根据NCBI上的绵羊的Tyrp2基因序列,寻找其启动子区域,构建真核表达载体,测序并分析启动子调控元件和转录因子结合位点。将不同片段长度的Tyrp2基因5’调控区的真核表达载体转染绵羊黑色素细胞,寻找表达启动子活性最好的Tyrp2基因5’调控区,并将绵羊pri-miR-27a连接到该真核表达载体的Tyrp2基因5’调控区下游,将该pri-miR-27a真核表达载体及阴性对照转染绵羊黑色素细胞,并检测实验组和对照组绵羊黑色素细胞中的miR-27a-3p的表达量。结果如下：1、三个miRNAs数据库均预测Wnt3a为miR-27a-3p的靶基因,Wnt3a3'UTR双荧光报告载体和miR-27a-3p真核表达载体共转染HEK 293 T细胞组的荧光活性降低41%。2、miR-27a-3p mimic、inhibitor及其NC转染小鼠黑色素细胞后,转染mimic的黑色素细胞中miR-27a-3p的表达量极显著高于其他组,而Wnt3a mRNA的表达量在各组之间差异不显著,最后,miR-27a-3p显著抑制Wnt3a蛋白的表达。3、绵羊Tyrp2基因5’调控区片段为834 bp的区域启动子活性最好。4、转染pri-miR-27a的绵羊黑色素细胞中,miR-27a-3p的表达量显著高于对照组。5、转染pri-miR-27a的绵羊黑色素细胞中,黑色素含量显著低于对照组。本研究证明Wnt3a为miR-27a-3p的靶基因,并且miR-27a-3p通过转录后调控Wnt3a的表达,从而抑制黑色素生成；miR-27a抑制绵羊黑色素生成。
【关键词】：miR-27a-3p Wnt3a 黑色素生成 Tyrp2启动子
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-10
• 第一部分 文献综述10-29
• 第一章 哺乳动物毛色生成及调控机制10-21
• 1 黑色素生成过程及机制10-12
• 2 黑色素生成的调控12-17
• 3 黑色素生成涉及的细胞通路17-21
• 3.1 干细胞因子(SCF)和它的受体17-19
• 3.2 Wnt通路19
• 3.3 α-MSH/MC1R通路19-20
• 3.4 内皮素通路20-21
• 第二章 miRNAs与毛色调控21-26
• 1 miRNA与毛色调控21-22
• 2 MiR-27a的功能研究22-26
• 第三章 黑色素细胞特异性启动子的研究进展26-29
• 1 启动子26
• 2 黑色素细胞特异性启动子26-29
• 第二部分 实验29-85
• 第一章 生物信息学预测和筛选miR-27a-3p靶基因及其验证29-52
• 1 材料与方法29-42
• 1.1 实验材料29
• 1.2 实验仪器及耗材29-30
• 1.3 实验方法30-42
• 2 结果42-49
• 2.1 miR-27a-3p的靶基因预测42
• 2.2 小鼠皮肤总RNA纯度及完整性的鉴定42-43
• 2.3 小鼠尾部基因组DNA纯度及完整性鉴定43
• 2.4 miR-27a真核表达载体的构建43-45
• 2.5 pmirGLO-Wnt3a 3’UTR的构建45
• 2.6 pmirGLO-Wnt3a 3’UTR突变及测序45-47
• 2.7 双荧光素报告载体与miRNAs真核表达载体共转染HEK 293 T细胞及荧光活性检测47-49
• 2.8 miR-27a-3p及其靶基因Wnt3a的内源性表达49
• 3 讨论49-51
• 4 结论51-52
• 第二章 miR-27a-3p对Wnt3a基因表达及黑色素生成的影响52-61
• 1 材料和方法52-56
• 1.1 实验样本52-53
• 1.2 实验方法53-56
• 2 结果56-58
• 2.1 小鼠黑色素细胞生长状态观察56-57
• 2.2 转染后细胞中miR-27a-3p和Wnt3a mRNA的表达水平57-58
• 2.3 转染后细胞中Wnt3a蛋白的表达水平58
• 2.4 转染后细胞中黑色素含量58
• 3 讨论58-60
• 4 结论60-61
• 第三章 绵羊Tyrp2基因5’调控区的克隆及其表达载体的构建61-71
• 1 材料与方法61-64
• 1.1 动物材料和质粒载体61
• 1.2 主要仪器设备及试剂61-62
• 1.3 引物设计62
• 1.4 绵羊皮肤基因组DNA提取62
• 1.5 绵羊Tyrp2基因5’调控区的PCR扩增62-63
• 1.6 PCR产物的纯化与克隆63
• 1.7 绵羊Tyrp2基因5’调控区真核表达载体的构建63-64
• 2 结果64-68
• 2.1 绵羊Tyrp2基因5’调控区PCR扩增结果64
• 2.2 绵羊Tyrp2基因5’调控区克隆结果64-65
• 2.3 绵羊Tyrp2基因5’调控区真核表达载体的构建65-67
• 2.4 绵羊Tyrp 2基因5’调控区的转录因子结合位点67-68
• 3 讨论68-70
• 4 结论70-71
• 第四章 绵羊Tyrp2基因5’调控区活性验证71-76
• 1 材料与方法71-72
• 1.1 实验材料71
• 1.2 主要仪器设备和试剂71-72
• 1.3 绵羊黑色素细胞的培养72
• 1.4 绵羊Tyrp2基因5’调控区真核表达载体转染绵羊黑色素细胞72
• 2 结果72-73
• 2.1 转染效率的优化72-73
• 2.2 绵羊Tyrp2基因5’调控区活性验证73
• 3 讨论73-75
• 4 结论75-76
• 第五章 绵羊Tyrp2启动子起始的pri-miR-27a表达对黑色素生成的影响76-85
• 1 材料与方法76-79
• 1.1 动物材料和质粒载体76
• 1.2 主要仪器设备及试剂76-77
• 1.3 引物设计77
• 1.4 绵羊耳组织基因组DNA提取77
• 1.5 绵羊pri-miR-27a的PCR扩增77-78
• 1.6 绵羊miR-27a真核表达载体的构建78-79
• 1.7 绵羊黑色素细胞的培养及转染79
• 1.8 绵羊黑色素细胞总RNA提取及cDNA的合成79
• 1.9 转染后细胞中miR-27a-3p表达水平的检测79
• 1.10 转染后绵羊黑色素细胞中黑色素含量检测79
• 2 结果79-83
• 2.1 绵羊耳组织基因组DNA的提取与鉴定79-80
• 2.2 pri-miR-27a PCR结果80
• 2.3 载体及PCR产物酶切回收80
• 2.4 重组质粒的PCR验证80-81
• 2.5 重组质粒测序结果81
• 2.6 转染效率81-82
• 2.7 转染后miR-27a-3p在绵羊黑色素细胞中的表达水平82-83
• 2.8 黑色素含量测定83
• 3 讨论83-84
• 4 结论84-85
• 参考文献85-93
• 全文总结93-94
• 研究创新与展望94-96
• Abstract96-98
• 中英文对照及缩写表98-100
• 附录 真核表达载体构建流程图100-102
• 博士期间发表论文102-104
• 致谢104

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1 赵园园;MiR-27a-3p对黑色素生成的作用及机制研究[D];山西农业大学;2015年

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本文编号：741431