海水鱼类病原菌迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的致病机制

发布时间：2017-08-29 13:34

  本文关键词：海水鱼类病原菌迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的致病机制

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【摘要】：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是海水养殖鱼类的重要病原菌。在本论文中,我们研究了迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的致病机制。首先,在迟缓爱德华氏菌研究中,我们分析了溶菌酶抑制因子MliCEt的功能作用以及MliCEt与另一个溶菌酶抑制因子IvyEt的关系。我们发现重组表达的MliCEt(rMliC)抑制溶菌酶裂解革兰氏阳性菌,并且抑制溶菌酶和血清对于迟缓爱德华氏菌的杀菌作用;同时,rMli C还能够增强迟缓爱德华氏菌感染大菱鲆的能力。C33S突变不影响MliC的活性,但W79A突变显著增强MliC的活性。与野生株相比,mliC和ivy的单敲除菌株TXΔmliC或TXΔivy的组织侵染、致死率、抗血清杀菌和胞内复制能力明显降低。TXΔmliC在导入mliCEt基因后恢复了毒力。与单敲除菌株TXΔmliC或TXΔivy相比,mliC和ivy的双敲除菌株TXΔmliCivy的毒力显著降低。这些结果证明MliC中保守的C33半胱氨酸位点是非必需的,并且MliCEt与IvyEt以协同的方式发挥作用。除了MliC以外,我们还研究了迟缓爱德华氏菌的抗血清机制。我们发现迟缓爱德华氏菌在鱼类血清中具有高存活率(87.6%),与迟缓爱德华氏菌孵育后的血清具有很强的溶血活性和杀菌活性但很低的趋化活性;相比与正常迟缓爱德华氏菌孵育后的血清,与灭活迟缓爱德华氏菌孵育后的血清没有明显的溶血活性。这些结果表明迟缓爱德华氏菌通过抑制补体旁路途径的激活来抵抗血清的杀伤作用,并且迟缓爱德华氏菌表面的热不稳定结构在其逃逸补体的过程中发挥重要的作用。在海豚链球菌的研究中,我们分析了细菌素Sil的生物学功能。我们发现重组表达的Sil(rSil)抑制枯草芽孢杆菌的生长,但是对于其他26种菌的生长没有影响。rSil能够与细菌结合但不杀死细菌。rSil与大菱鲆头肾单核细胞相互作用,从而抑制细胞的先天免疫反应并增强海豚链球菌的感染能力。抗体阻断Sil显著降低了海豚链球菌的感染能力。体内感染表明rSil能够增强海豚链球菌在大菱鲆组织中的侵染能力。这些结果表明Sil是一种新颖的毒力相关细菌素,其能够通过阻遏宿主的免疫反应而促进细菌感染。
【关键词】：迟缓爱德华氏菌 溶菌酶抑制因子 补体 海豚链球菌 细菌素
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.4
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 前言12-42
• 1.1 迟缓爱德华氏菌12-16
• 1.1.1 迟缓爱德华氏菌研究概况12
• 1.1.2 迟缓爱德华氏菌的生物学危害12-13
• 1.1.3 迟缓爱德华氏菌的感染及毒力因子的相互作用13-15
• 1.1.4 毒力机制和发病机理15-16
• 1.1.5 迟缓爱德华氏菌致病机制的调控和干扰16
• 1.2 溶菌酶抑制因子16-26
• 1.2.1 溶菌酶17-18
• 1.2.2 细菌溶菌酶抑制因子的特性和系统发育18-21
• 1.2.3 溶菌酶抑制因子的结构及与溶菌酶的相互作用21-23
• 1.2.4 溶菌酶抑制因子的生物学功能23-26
• 1.3 补体系统26-31
• 1.3.1 补体系统的组成26-27
• 1.3.2 补体激活途径27-29
• 1.3.3 鱼类补体系统29-30
• 1.3.4 补体的生物学功能30-31
• 1.4 海豚链球菌31-36
• 1.4.1 海豚链球菌的分布31-32
• 1.4.2 海豚链球菌宿主范围32
• 1.4.3 鉴别和归类32-33
• 1.4.4 海豚链球菌疾病33-35
• 1.4.5 海豚链球菌病的预防与治疗35-36
• 1.5 细菌素36-40
• 1.5.1 细菌素的产生36
• 1.5.2 细菌素的分布和特点36-39
• 1.5.3 细菌素的分子特征39
• 1.5.4 细菌素的作用模式39-40
• 1.5.5 细菌素在食品中的应用40
• 1.6 本论文研究目的与意义40-42
• 第二章 迟缓爱德华氏菌溶菌酶抑制因子MliC功能的研究42-74
• 2.1 材料、方法及仪器设备42-56
• 2.1.1 实验材料及仪器设备42-43
• 2.1.2 序列分析43
• 2.1.3 迟缓爱德华氏菌TX01 MliC家族基因的获得43-47
• 2.1.4 MliC表达载体的构建47-48
• 2.1.5 pETMliCEt在大肠杆菌中的表达48-50
• 2.1.6 重组突变蛋白rMliCC33S和rMliCW79A的制备50-51
• 2.1.7 迟缓爱德华氏菌敲除株TXΔmliC、TXΔmliCivy和互补株TXΔmliC+mliC的构建51-52
• 2.1.8 双敲除株TXΔmliCivy的获得52
• 2.1.9 互补菌株TXΔmliC+mliC的获得52
• 2.1.10 重组蛋白r MliC抗体的制备52-53
• 2.1.11 免疫印迹Western blot分析53
• 2.1.12 溶菌酶抑制活性分析53-54
• 2.1.13 rMliC对于迟缓爱德华氏菌在体内感染中的作用54
• 2.1.14 组织侵染和致死率分析54
• 2.1.15 抗血清能力分析54-55
• 2.1.16 细菌在头肾单核细胞（HKM）中的胞内能力分析55
• 2.1.17 酸性磷酸酶分析55-56
• 2.2 结果56-69
• 2.2.1 MliCEt序列分析56-58
• 2.2.2 rMliC的溶菌酶抑制活性58-59
• 2.2.3 rMliC对于迟缓爱德华氏菌存活的作用59-62
• 2.2.4 rMliCEt的胞外产生62
• 2.2.5 rMliC保守氨基酸功能的重要性62-64
• 2.2.6 在不同方面比较迟缓爱德华氏菌野生株和突变株的感染能力64-69
• 2.3 讨论69-74
• 第三章 迟缓爱德华氏菌通过阻止补体旁路途径的激活逃逸血清杀伤作用的研究74-84
• 3.1 材料、方法及仪器设备74-76
• 3.1.1 实验材料及仪器设备74
• 3.1.2 血清中存活率分析74-75
• 3.1.3 与细菌孵育后血清溶血和杀菌活性检测75
• 3.1.4 趋化实验分析75-76
• 3.2 结果与讨论76-84
• 3.2.1 迟缓爱德华氏菌在鱼血清中的存活76-78
• 3.2.2 与迟缓爱德华氏菌孵育后剩余血清补体活性78-80
• 3.2.3 与迟缓爱德华氏菌孵育后剩余血清补体活性80-82
• 3.2.4 失活的迟缓爱德华氏菌对于补体激活的作用82-84
• 第四章 海豚链球菌细菌素Sil抑菌功能和免疫调节功能的研究84-103
• 4.1 材料、方法及仪器设备84-88
• 4.1.1 实验材料及仪器设备84-85
• 4.1.2 序列分析85
• 4.1.3 海豚链球菌Sil基因的获得。85
• 4.1.4 海豚链球菌rSil重组蛋白及抗体制备85-86
• 4.1.5 免疫印迹对rSil进行定位分析86
• 4.1.6 rSil抗细菌作用分析86
• 4.1.7 海豚链球菌SF1上清的抑菌作用分析86
• 4.1.8 rSil与细菌相互作用86-87
• 4.1.9 rSil对于海豚链球菌感染大菱鲆头肾单核细胞的作用87
• 4.1.10 rSil与大菱鲆头肾单核细胞相互作用87
• 4.1.11 酸性磷酸酶分析87-88
• 4.1.12 rSil抗体对于海豚链球菌感染大菱鲆头肾单核细胞的作用88
• 4.1.13 rSil在海豚链球菌体内感染中的作用88
• 4.2 结果88-100
• 4.2.1 Sil序列分析88-89
• 4.2.2 Sil的胞外产生89-91
• 4.2.3 rSil的抗细菌作用91-92
• 4.2.4 海豚链球菌上清的抑菌作用92-93
• 4.2.5 rSil与靶细菌结合93-95
• 4.2.6 rSil与头肾单核细胞结合和抑制细胞免疫方面的作用95-98
• 4.2.7 rSil抗体对于海豚链球菌感染细胞的作用98-99
• 4.2.8 rSil对于海豚链球菌在鱼组织内侵染情况的影响99-100
• 4.3 讨论100-103
• 结论103-104
• 参考文献104-120
• 附录 常见溶液的配制120-124
• 作者简历124-125
• 博士期间发表的文章与研究成果125-126

【共引文献】

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