葡萄遗传转化体系与转抗病相关基因研究

发布时间：2017-08-29 21:40

  本文关键词：葡萄遗传转化体系与转抗病相关基因研究

  更多相关文章： 葡萄 白粉病 抗病基因 遗传转化 抗病育种

【摘要】：欧洲葡萄品种(Vitis vinifera L.)品质优良、被广泛栽培在世界广大地区,其主要缺点是抗病性差;改良优质欧洲葡萄品种抗病性成为葡萄抗病育种的目标之一。遗传工程转基因生物技术是定向改良葡萄抗病性快捷途径之一。本研究以酿酒葡萄品种霞多丽(V.vinifera cv.Chardonnay)、梅鹿特(V.vinifera cv.Merlot)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)、品丽珠(V.vinifera cv.Cabernet Franc)、鲜食葡萄品种红地球(V.vinifera cv.Red Globe)为材料,建立并优化葡萄体细胞胚发生途径。在此再生途径的基础上,建立葡萄遗传转化体系,将课题组前期从抗白粉病的华东葡萄白河葡萄-35-1中克隆的抗白粉病相关基因芪合成酶基因Vp STSg DNA2、泛素连接酶基因Vp UR9、病程相关蛋白基因Vp PR4-1,通过农杆菌介导方法转化至感病的欧洲葡萄品种中,研究基因的抗病功能,为改良欧洲葡萄品种抗病性提供依据。本研究取得的主要结果如下:1.体细胞胚再生途径建立:霞多丽、梅鹿特、品丽珠、赤霞珠的花蕾在胚性愈伤诱导培养基(MS1、PIV、MC)上能够诱导出胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC),基因型影响胚性愈伤诱导率,其中霞多丽、梅鹿特的平均胚性愈伤诱导效率分别为12.00%和9.05%,高于品丽珠(0.03%)、赤霞珠(0.83%)。三种胚性愈伤诱导培养基中,PIV培养基适于多种基因型葡萄胚性愈伤诱导。霞多丽、品丽珠、赤霞珠适宜在PIV培养基上诱导胚性愈伤,其诱导率分别为13.8、0.1和1.3%;梅鹿特在MC培养基上胚性愈伤诱导效率较好,为12.1%。添加毒莠定能提高霞多丽胚性愈伤诱导效率。霞多丽小花蕾在2.0mg L-16-BA、0.5mg L-12,4-D、3.0mg L-1毒莠定的MS培养基上诱导效率提高至16.4%。梅鹿特和实验室前期诱导的红地球葡萄的胚性愈伤在X6培养基上能够保持和扩繁,霞多丽适宜的胚性保持和扩繁培养基是添加2mg L-1毒莠定的MS培养基。梅鹿特和红地球体细胞胚(Somatic embryo,SE)在添加0.2mg L-16-BA的MS培养基成苗数分别为57、63株/0.1g原胚团(Proembryonic masses,PEM)。而霞多丽葡萄在此培养基上成苗数为18株/0.1g PEM,通过优化培养基成分,霞多丽适宜的体细胞胚萌发成苗培养基是0.2mg L-1KT、0.1mg L-1NOA的MS培养基。2.遗传转化方法比较与获得转芪合成酶基因葡萄植株:利用农杆菌介导和基因枪转化方法,将葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)转入霞多丽PEM中,并对抗性的体胚进行GUS染色,结果表明农杆菌介导的获得的抗性体细胞胚中GUS表达量高于基因枪遗传转化法。利用农杆菌介导法将芪合成酶基因Vp STSg DNA2转化欧洲葡萄品种霞多丽、梅鹿特、红地球的胚性愈伤、原胚团、体细胞胚三种类型的胚性材料中,结果表明不同胚性材料的转化效率不同。胚性愈伤和体细胞胚在筛选过程中褐化、不能恢复,原胚团在筛选过程中再生形成抗性材料,因此原胚团为葡萄的适宜的遗传转化受体材料。基因型影响原胚团的恢复与再生,试验中分别获得69、3、2株霞多丽、梅鹿特、红地球的抗性株系。PCR检测结果表明,32株霞多丽抗性株系为阳性株系,其余葡萄未检测到目的片段。3.转芪合成酶基因Vp STSg DNA2葡萄植株分子检测:转白河-35-1中芪合成酶基因Vp STSg DNA2的霞多丽叶片接种白粉菌[Uncinula necator(Schw.)Burr.]表明,转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽叶片中Vp STSg DNA2受白粉菌诱导转录;在Vp STSg DNA2转录的同时,查尔酮合成酶基因转录受抑制,Vp STSg DNA2的产物反式白藜芦醇和ε-葡萄素含量的增加。同时,转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽葡萄叶片中有H2O2的积累。转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽葡萄叶片上的白粉菌菌丝密度低于对照霞多丽葡萄叶片。初步表明,欧洲葡萄品种霞多丽转入Vp STSg DNA2基因的植株能够抑制白粉菌菌丝的生长、提高转基因植株对白粉菌的抗病能力。4.获得转泛素连接酶基因Vp UR9葡萄植株与分子检测:利用同源克隆方法,分离获得华东葡萄白河-35-1泛素连接酶基因Vp UR9,经预测分析,该基因编码164个氨基酸,具有保守RING结构域,该基因转录受白粉菌和水杨酸调控。构建该基因植物表达载体,并通过农杆菌介导转入欧洲葡萄品种霞多丽、梅鹿特、红地球中过量表达。通过筛选得到15个转化泛素连接酶基因Vp UR9红地球株系,对FLAG-tag进行western blotting检测,其阳性率为80%,其余葡萄未获得阳性植株,Kan抗性适宜红地球葡萄的转化及筛选。接种白粉菌结果表明,转泛素连接酶基因Vp UR9的红地球对白粉菌的抗性减弱。5.获得转病程相关蛋白基因Vp PR4-1葡萄植株与分子检测:利用同源克隆方法,分离获得华东葡萄白河-35-1中的病程相关蛋白基因Vp PR4-1。经预测分析,该基因编码143个氨基酸,其转录受白粉菌、水杨酸、茉莉酸甲酯调控。Vp PR4-1蛋白具有DNase活性,该蛋白定位于细胞核、细胞质、细胞膜上。构建病程相关蛋白基因Vp PR4-1过量植物表达载体,并通过农杆菌介导转化法将其转入欧洲葡萄品种红地球中。最终得到30株红地球转化病程相关蛋白基因Vp PR4-1的红地球植株,对Vp PR4-1进行western blotting检测,其中26个株系Vp PR4-1蛋白表达量升高。通过白粉菌接种及观察,初步认为转化病程相关蛋白基因Vp PR4-1的红地球葡萄对白粉菌的抗性增强。综上,欧洲葡萄品种转入中国野生葡萄抗病基因是可行的,这为定向改良与提高栽培的欧洲葡萄品种的抗病性提供了依据;下一步研究重点是优化调节胚性愈伤组织扩繁方法,延长胚性材料的保存方法与增殖效率;提高转基因效率;促进转基因植株生长发育,按照科学程序,进入田间观察开花结果,为这项研究的应用提供有价值的依据。
【关键词】：葡萄 白粉病 抗病基因 遗传转化 抗病育种
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S663.1
【目录】：

• 摘要6-8
• 英文摘要8-15
• 第一章 文献综述15-25
• 1.1 葡萄遗传转化研究简介15-20
• 1.1.1 葡萄再生途径16-19
• 1.1.2 葡萄遗传转化方法19-20
• 1.1.3 转基因葡萄植株的筛选20
• 1.2 葡萄抗白粉病研究简介20-21
• 1.2.1 葡萄白粉病20-21
• 1.2.2 葡萄抗白粉病简介21
• 1.3 葡萄3个抗白粉病基因的研究简介21-24
• 1.3.1 葡萄抗白粉病芪合成酶基因21-22
• 1.3.2 葡萄抗白粉病泛素连接酶基因22-23
• 1.3.3 葡萄抗白粉病病程相关蛋白基因23-24
• 1.4 本研究的目的和意义24-25
• 第二章 欧洲葡萄品种体细胞胚胎发生途径的建立及转基因方法筛选25-40
• 2.1 材料和试剂25-26
• 2.1.1 供试葡萄植物材料25
• 2.1.2 供试植物表达载体及菌株25
• 2.1.3 主要试剂25-26
• 2.1.4 主要仪器26
• 2.2 方法26-29
• 2.2.1 葡萄品种器官发生途径的建立26
• 2.2.2 葡萄品种体细胞胚发生途径的建立26-27
• 2.2.3 葡萄品种体细胞胚发育各个时期的形态学观察27
• 2.2.4 葡萄品种农杆菌介导和基因枪法转基因效率的比较27-28
• 2.2.5 数据分析28-29
• 2.3 结果与分析29-37
• 2.3.1 葡萄品种器官发生途径的建立29
• 2.3.2 欧洲葡萄品种胚性愈伤组织的诱导的影响因素29-33
• 2.3.3 葡萄品种胚性愈伤组织的保持与扩繁培养基的筛选33-34
• 2.3.4 葡萄品种体细胞胚的萌发与成苗培养基筛选34-36
• 2.3.5 葡萄品种农杆菌介导法和基因枪法转基因GUS染色结果比较36-37
• 2.4 讨论37-39
• 2.5 小结39-40
• 第三章 欧洲葡萄品种遗传转化体系建立与转华东葡萄白河351 芪合成酶基因研究 .. 2640-53
• 3.1 材料和试剂40-41
• 3.1.1 供试葡萄植物材料40
• 3.1.2 供试植物表达载体及菌株40
• 3.1.3 葡萄白粉菌40-41
• 3.1.4 主要试剂41
• 3.1.5 主要仪器41
• 3.2 方法41-43
• 3.2.1 华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 转化欧洲葡萄品种41-42
• 3.2.2 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄抗性植株检测42
• 3.2.3 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄品种植株接种白粉菌及H2O2检测42
• 3.2.4 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄品种植株接种白粉菌目的基因转录水平检测42-43
• 3.2.5 转化芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄植株接种白粉菌芪类物质的HPLC检测43
• 3.2.6 数据分析43
• 3.3 结果与分析43-50
• 3.3.1 欧洲葡萄品种转化华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 与抗性植株分子检测43-46
• 3.3.2 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄品种霞多丽叶片接种白粉菌及H2O2检测46-48
• 3.3.3 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的欧洲葡萄品种霞多丽葡萄叶片接种白粉菌目的基因转录水平检测48-50
• 3.3.4 转华东葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的霞多丽葡萄叶片接种白粉菌芪类物质的HPLC检测50
• 3.4 讨论50-52
• 3.5 小结52-53
• 第四章 华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 转化欧洲葡萄品种的研究53-67
• 4.1 材料和试剂53-54
• 4.1.1 供试葡萄植物材料53
• 4.1.2 供试植物表达载体及菌株53
• 4.1.3 主要试剂53-54
• 4.1.4 主要仪器54
• 4.2 方法54-56
• 4.2.1 华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 序列比对与聚类分析54
• 4.2.2 华东葡萄白河351 和欧洲葡萄品种黑比诺叶片在白粉菌、水杨酸处理时泛素连接酶基因VpUR9 的转录变化54
• 4.2.3 华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 构建植物过量表达载体并转化欧洲葡萄品种54-55
• 4.2.4 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种抗性植株的分子检测55
• 4.2.5 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种抗性植株的western blotting检测55
• 4.2.6 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种植株的白粉病抗性检测55
• 4.2.7 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种植株的抗病相关标记基因表达量分析55-56
• 4.3 结果与分析56-65
• 4.3.1 华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 序列分析与相近物种序列比对及聚类分析56-58
• 4.3.2 华东葡萄白河351 及欧洲葡萄品种黑比诺中泛素连接酶基因VpUR9 对白粉菌和水杨酸的响应58-59
• 4.3.3 华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 转化欧洲葡萄品种59-61
• 4.3.4 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种红地球抗性植株的分子检测及western blotting61-62
• 4.3.5 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 欧洲葡萄品种红地球的白粉病抗性检测62-64
• 4.3.6 转华东葡萄白河351 泛素连接酶基因VpUR9 对欧洲葡萄品种红地球葡萄植株抗病相关标记基因表达的影响64-65
• 4.4 讨论65-66
• 4.5 小结66-67
• 第五章 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1转化欧洲葡萄品种红地球的研究67-80
• 5.1 材料和试剂67-68
• 5.1.1 供试植物材料67
• 5.1.2 供试植物表达载体及菌株67
• 5.1.3 主要试剂67-68
• 5.1.4 主要仪器68
• 5.2 方法68-69
• 5.2.1 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 序列比对与聚类分析68
• 5.2.2 华东葡萄白河351 白粉菌侵染、外源激素喷施、逆境胁迫下病程相关蛋白基因VpPR4-1 表达分析68
• 5.2.3 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 克隆、亚细胞定位与VpPR4-1蛋白的DNase活性分析68-69
• 5.2.4 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 植物表达载体的构建与转化欧洲葡萄品种红地球69
• 5.2.5 转华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 欧洲葡萄品种红地球白粉菌抗性鉴定与抗病相关标记基因表达定量分析69
• 5.3 结果与分析69-78
• 5.3.1 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 序列比对与聚类分析69-71
• 5.3.2 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 对白粉菌、外源激素及逆境胁迫的响应71-73
• 5.3.3 华东葡萄白河351 病程相关蛋白VpPR4-1 的DNase活性分析73
• 5.3.4 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 亚细胞定位73-74
• 5.3.5 华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 植物表达载体的构建与转化欧洲葡萄品种红地球74-76
• 5.3.6 转华东葡萄白河351 病程相关蛋白基因VpPR4-1 欧洲葡萄品种红地球白粉菌抗性鉴定与抗病相关标记基因表达分析76-78
• 5.4 讨论78-79
• 5.5 小结79-80
• 第六章 结论80-81
• 参考文献81-94
• 缩略词94-95
• 致谢95-96
• 作者简介96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 潘学军;李顺雨;张文娥;刘崇怀;;‘森田尼无核’葡萄胚发育及败育的细胞学特征[J];北方园艺;2011年05期

2 张今今,王跃进,王西平,杨克强,杨进孝;葡萄总RNA提取方法的研究[J];果树学报;2003年03期

3 巩鹏涛;黄东杰;黄昭奋;;中国转基因作物,机遇与挑战[J];基因组学与应用生物学;2009年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 朱自果;中国野生华东葡萄cDNA文库测序及转录因子基因ERF和NAC功能分析[D];西北农林科技大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 谭超;欧洲葡萄体胚诱导及转化中国野葡萄芪合成酶基因的研究[D];西北农林科技大学;2012年

，

本文编号：755591