水禽与哺乳类RIG-I抗流感病毒功能比较研究

发布时间：2017-09-03 00:15

  本文关键词：水禽与哺乳类RIG-I抗流感病毒功能比较研究

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【摘要】：维甲酸诱导基因I (retinoic acid-inducible gene I, RIG-I),是一类胞质模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),它能够识别RNA病毒的ssRNA或病毒复制过程中产生的dsRNA,并启动Ⅰ型干扰素相关抗病毒先天性免疫反应。 RIG-I蛋白序列生物信息学分析显示,鸟类RIG-I与爬行类亲缘关系较近,但与哺乳类较远。RIG-I磷酸化位点和泛素化位点数量在鱼类-爬行类-哺乳类进化轴上逐渐增加,但泛素化位点数量在鱼类-爬行类-鸟类进化轴上先增加后减少。这说明RIG-I在爬行类向哺乳类和鸟类进化过程中,调控机制的复杂化程度出现了较大差异。 水禽(鸭子和鹅)与哺乳类(人和小鼠)RIG-I表达量和亚细胞定位显示,水禽RIG-Ⅰ及其CARDs (Caspase recuriment domains, CARDs)表达量显著高于哺乳类RIG-Ⅰ和CARDs。密码子偏好性分析显示水禽RIG-I在人的表达系统中适应性高于人和小鼠RIG-I,而稀有密码子数则少于人和小鼠RIG-I,这可能是人和小鼠RIG-I表达量较低的原因。 水禽与哺乳类RIG-I抗流感病毒能力比较显示,鸭子和鹅RIG-I/CARDs在鸡的细胞中可显著性增强IFN-β, Mx, PKR表达量,并抑制流感病毒复制,但人和小鼠RIG-I/CARDs在鸡的细胞中则无法行使其抗病毒功能。相反,人和小鼠RIG-I/CARDs在人肺癌细胞系A549中可显著性上调IFN-β,Mx,PKR等抗病毒基因表达并抑制流感病毒复制。但鸭RIG-I及其CARDs在A549细胞中作用较弱,鹅RIG-I反而抑制干扰素表达。以上结果说明RIG-I只能在亲缘关系较近的物种中发挥其抗病毒作用。 为明确鸭子和鹅RIG-I诱导干扰素诱导能力差异的原因,我们将dCARDs (duckCARDs)与gCARDs (gooseCARDs)的CARD1结构域互换。结果表明dCARDl替换gCARDs中的gCARDl导致其干扰素诱导能力降低,dCARD2替换gCARDs中的gCARD2导致其干扰素诱导能力增强。这说明CARD1上部分氨基酸位点差异导致鸭子和鹅RIG-Ⅰ干扰素诱导能力不同。点突变证实dCARDs第8位丝氨酸负调控其干扰素诱导。因此我们认为鹅RIG-Ⅰ第8位缺少丝氨酸可能使其不受到磷酸化负调控,从而对干扰素诱导能力更强。 为验证dRIG-Ⅰ是否在鸭胚胎成纤维细胞(DEF)识别流感病毒过程中起关键作用,我们利用siRNA干扰DEF细胞中RIG-Ⅰ基因的表达。结果显示RIG-Ⅰ表达量的降低导致ZB07病毒M基因表达上调,干扰素表达显著性降低。这说明DEF能够利用RIG-Ⅰ识别流感病毒,进而诱导抗病毒先天性免疫反应。为验证dRIG-Ⅰ能否为RIG-Ⅰ天然缺失的鸡DF-1细胞提供抗病毒保护作用,我们在DF-1细胞中进行dRIG-Ⅰ过表达和禽流感病毒ZB07感染。结果显示RIG-Ⅰ可抑制ZB07病毒诱导的鸡DF-1细胞凋亡,减少细胞病变。以上结果暗示鸭子RIG-Ⅰ在鸭子识别禽流感病毒中起至关重要的作用,并且可以作为改善鸡对流感病毒敏感性的备选基因。 综上所述,本研究揭示了脊椎动物RIG-Ⅰ的进化规律,水禽与哺乳类RIG-Ⅰ之间功能差异,以及鸭子RIG-Ⅰ在识别流感病毒过程中的作用。这些研究结果为禽类RIG-Ⅰ抗流感功能的进一步研究提供了理论依据。
【关键词】：RIG-I 流感病毒 干扰素 水禽 哺乳类
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• ~.略词表9-10
• 第一章 引言10-24
• 1.1 天然免疫10
• 1.2 模式识别受体10-11
• 1.3 TLRs11-13
• 1.3.1 TLRs的分布11
• 1.3.2 TLRs识别的配体11-12
• 1.3.3 TLRs介导的信号转导12-13
• 1.4 NLRs13-14
• 1.4.1 NLRs识别的配体13
• 1.4.2 NLRs介导的信号转导13-14
• 1.5 RLRs14-19
• 1.5.1 RLRs识别配体14-15
• 1.5.2 RIG-Ⅰ分子结构15-17
• 1.5.3 RLRs介导的信号转导17
• 1.5.4 RIG-Ⅰ磷酸化与泛素化修饰17-19
• 1.5.5 病原体拮抗RIG-Ⅰ信号通路19
• 1.6 流感病毒19-23
• 1.6.1 流感病毒宿主范围与分类20
• 1.6.2 基因组及其编码蛋白20-22
• 1.6.3 流感病毒复制过程22-23
• 1.7 研究目的与意义23-24
• 第二章 材料与方法24-44
• 2.1 实验材料24-27
• 2.1.1 质粒与菌株24
• 2.1.2 实验动物与鸡胚24
• 2.1.3 病毒与细胞系24
• 2.1.4 试剂及试剂盒24-25
• 2.1.5 实验仪器25
• 2.1.6 主要试剂配制25-27
• 2.1.7 实验数据分析相关软件27
• 2.2 实验方法27-44
• 2.2.1 感受态细胞的制备27
• 2.2.2 感受态细胞的转化27-28
• 2.2.3 质粒提取28-29
• 2.2.4 质粒酶切29-30
• 2.2.5 DNA回收30
• 2.2.6 目的片段与载体的重组30-31
• 2.2.7 RNA提取31-32
• 2.2.8 RT-PCR32
• 2.2.9 PCR反应32-38
• 2.2.10 Western Blot38-39
• 2.2.11 细胞培养39-41
• 2.2.12 AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡41
• 2.2.13 激光共聚焦显微镜观察细胞定位41-42
• 2.2.14 病毒增殖42
• 2.2.15 红细胞凝集实验42
• 2.2.16 荧光半数组织感染量(TCID50)的测定42-43
• 2.2.17 引物合成与测序43
• 2.2.18 实验数据的分析与图片处理43-44
• 第三章 结果与分析44-75
• 3.1 RIG-Ⅰ生物信息学分析44-51
• 3.1.1 RIG-Ⅰ蛋白序列进化分析44-46
• 3.1.2 RIG-Ⅰ蛋白序列修饰位点差异分析46-51
• 3.2 水禽与哺乳类来源RIG-Ⅰ细胞表达与定位比较51-58
• 3.2.1 鸭、人和小鼠RIG-Ⅰ cDNA的克隆51
• 3.2.2 RIG-Ⅰ基因测序鉴定51
• 3.2.3 鸭、鹅、人和小鼠RIG-Ⅰ两端加同源臂51-52
• 3.2.4 重组质粒菌液PCR鉴定52-53
• 3.2.5 质粒电泳与测序鉴定53-54
• 3.2.6 四种RIG-Ⅰ和CARDs在DF-1细胞中表达量差异比较54-55
• 3.2.7 四种RIG-Ⅰ和CARDs在293T细胞中表达量差异比较55-56
• 3.2.8 RIG-Ⅰ密码子偏好性分析56-57
• 3.2.9 四种RIG-Ⅰ和CARDs在DF-1细胞中的亚细胞定位比较57-58
• 3.2.10 四种RIG-Ⅰ和CARDs在293T细胞中的亚细胞定位比较58
• 3.3 水禽与哺乳类来源RIG-Ⅰ抗流感病毒能力比较58-66
• 3.3.1 水禽RIG-Ⅰ在DF-1细胞中抗病毒基因诱导能力高于哺乳类RIG-Ⅰ59-61
• 3.3.2 哺乳类RIG-Ⅰ在293T细胞中抗病毒基因诱导能力高于水禽RIG-Ⅰ61-62
• 3.3.3 哺乳类RIG-Ⅰ在A549细胞中抗病毒基因诱导能力高于水禽RIG-Ⅰ62-63
• 3.3.4 水禽RIG-Ⅰ在DF-1细胞中抑制流感病毒复制能力高于哺乳类RIG-Ⅰ63-64
• 3.3.5 哺乳类RIG-Ⅰ在A549细胞中抑制流感病毒复制能力高于水禽RIG-Ⅰ64-65
• 3.3.6 哺乳类RIG-Ⅰ在MDCK细胞中抑制流感病毒复制能力高于水禽RIG-Ⅰ65-66
• 3.4 鸭和鹅RIG-Ⅰ干扰素诱导差异机制66-72
• 3.4.1 CARDs替换对RIG-Ⅰ表达量和细胞定位影响67-68
• 3.4.2 重组CARDs/RIG-Ⅰ在DF-1中表达量差异比较68-69
• 3.4.3 重组CARDs/RIG-Ⅰ在293T中表达量差异比较69-70
• 3.4.4 鸭和鹅RIG-Ⅰ CARDs结构域交换导致RIG-Ⅰ超激活70-71
• 3.4.5 Ser8磷酸化负调控dCARDs干扰素激活71-72
• 3.5 鸭RIG-Ⅰ在鸭和鸡细胞中识别流感病毒并诱导抗病毒反应72-75
• 3.5.1 DEF中干扰dRIG-Ⅰ抑制IFN-β表达,促进流感病毒复制73
• 3.5.2 DF-1细胞中过表达dRIG-Ⅰ抑制禽流感病毒诱导的细胞凋亡73-75
• 第四章 讨论与展望75-80
• 4.1 鸟类与哺乳类RIG-Ⅰ进化关系存在较大差异75
• 4.2 水禽RIG-Ⅰ表达量高于哺乳动物来源RIG-Ⅰ75
• 4.3 水禽与哺乳类RIG-Ⅰ细胞定位类似75-76
• 4.4 水禽与哺乳类来源RIG-Ⅰ基因只在亲缘关系较近的宿主中发挥作用76-77
• 4.5 鸭和鹅RIG-Ⅰ结构域重组导致其持续激活77-78
• 4.6 鸭胚胎成纤维细胞利用RIG-Ⅰ识别禽流感病毒78
• 4.7 dRIG-Ⅰ为鸡成纤维细胞提供保护作用78-79
• 4.8 结论与展望79-80
• 4.8.1 结论79
• 4.8.2 展望79-80
• 参考文献80-92
• 致谢92-93
• 附录93-102
• 个人简历102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 余华;;猪流感病毒分子生物学研究进展[J];动物医学进展;2010年S1期

2 王彦辉;郑明学;;禽流感病毒基因组编码的蛋白及功能[J];国外畜牧学(猪与禽);2007年02期

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本文编号：781725