香鳞毛蕨4CL基因家族的克隆及功能验证

发布时间：2017-09-12 02:00

  本文关键词：香鳞毛蕨4CL基因家族的克隆及功能验证

  更多相关文章： 香鳞毛蕨 4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL) 功能验证 遗传转化

【摘要】：香鳞毛蕨是多年生药用真蕨类植物,在我国以黑龙江省为分布中心,特别是五大连池地区分布面积较大。由于其独特的生长环境和生长特点赋予了香鳞毛蕨独特的药用价值。香鳞毛蕨作为民间用药,主要用于治疗关节炎和各种皮肤病,包括银屑病、痤疮、皮疹和皮炎等,国内外学者研究发现,香鳞毛蕨还具有较强的驱虫、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多重作用。迄今为止,一些研究人员主要在形态解剖学观察、化学成分的提取分离及药理活性等方面对香鳞毛蕨进行研究,关于香鳞毛蕨中次生代谢途径相关酶基因的研究进行的较少。因此,模拟香鳞毛蕨特殊生境的温光处理对香鳞毛蕨有效成分的积累,并从分子角度阐明其调控机制,为实现我国野生香鳞毛蕨资源的有效保护和有效成分的可持续利用提供理论依据,应用前景十分广阔。在植物体中,包括木质素和黄酮类化合物等次级代谢产物都是由苯丙烷类代谢途径产生的,这些次级代谢产物不但对植物体自身具有重要的作用,而且对人体的健康具有重要作用,因此,苯丙烷代谢途径及途径中的关键酶成为人们研究的热点。在这条代谢途径中,4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)位于主途径向分支途径过渡的关键点上,控制进入不同的苯丙烷类化合物代谢支路,产生不同的次级代谢产物,并且研究发现4CL基因属基因家族形式,不同的4CL基因可控制代谢途径的不同方向,研究4CL基因家族成员对次级代谢产物调控及次级代谢物质的积累有重要意义,也为广泛研究及应用香鳞毛蕨的次级代谢产物打下坚实基础。本试验在前期的温光诱导香鳞毛蕨转录组的测序的研究中,确定苯丙烷类衍生物代谢途径是香鳞毛蕨黄酮类化合物的重要代谢途径,这与被子植物的苯丙烷类代谢较为相似。其中,4-香豆酸辅酶A连接酶基因则是这个代谢途径中的关键酶基因。目前,4CL基因在被子植物、裸子植物、苔藓植物已经被广泛的研究,而对于蕨类植物中则鲜有报道。本研究结合本课题组对香鳞毛蕨转录组测序结果的分析,从中筛选出4-香豆酸辅酶A连接酶基因,得到的主要试验结果如下:1.本研究通过从本组前期试验获得温光处理的香鳞毛蕨转录组文库中筛选并选定Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All 4条基因,通过序列比对发现,4个基因与已知植物4CL基因具有高度同源性,并以此为核心片段,进行后续试验。2.本文中通过RACE技术,将获得的4个核心片段进行全长的序列扩增,获得4个全长基因,并将Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All命名为Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3、Df4CL4。进一步研究这四个基因,发现都具有两个功能保守域Box I(SSGTTGLPKGV)和Box II(GEICIRG)及底物结合区Sbd I和Sbd II,并与公开发表的其他植物中的4CL基因具有高度的一致性。这4个基因之间的一致性为66.00%,编码分别539、565、552和573个氨基酸,4个基因推测的氨基酸序列之间的一致性为56.59%。确定这4个基因为4-香豆酸辅酶A连接酶基因,并确定为一个基因家族。3.本文运用CHIPS、CUSP和Codon W在线程序对自主克隆的香鳞毛蕨4CL基因(Df4CL)序列进行分析,并与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草等基因进行比较,对了解Df4CL基因密码子使用特性,为其选择合适的表达系统具有重要意义。研究发现,香鳞毛蕨4CL基因对ATGC选择没有偏向性,并且与小立碗藓的密码子使用偏好性相一致。在密码子使用频率上,Df4CL基因与拟南芥的差异小于与烟草、大肠杆菌、酵母的差异;基于4CL基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,香鳞毛蕨与小立碗藓、拟南芥聚为一类,因此预示香鳞毛蕨4CL基因更适合在拟南芥中外源表达。4.通过在线软件等生物信息学方法和手段分析香鳞毛蕨4CL蛋白的情况,研究发现,香鳞毛蕨4CL的4个蛋白均属于两性蛋白质,DF4CL2蛋白无跨膜区,DF4CL1、DF4CL3和DF4CL4蛋白有两个跨膜区,4个蛋白均无信号肽,并预测了4CL蛋白的高级结构,为今后对该蛋白的结构、功能和可能的酶催化机制、与底物结合位点等相关研究提供重要理论基础。5.香鳞毛蕨Df4CLs基因组织表达与总黄酮和总木质素含量之间基本正相关,在基因表达量高的组织中总黄酮和总木质素含量也较高,这说明从香鳞毛蕨中扩增出来的基因Df4CLs参与总黄酮和总木质素含量的合成。6.香鳞毛蕨4CL基因的表达还能被温度激活。在低温(4℃)或者高温(35℃)条件下,4个基因都表现为先增大后减少的趋势,而香鳞毛蕨中黄酮类化合物含量和木质素含量变化趋势与之基本一致,但峰值点不相同,一般而言,黄酮类化合物和总木质素含量达到最高点的峰值要比基因滞后,温度除影响基因的表达量外,还可能影响物质合成中酶的活性,导致含量的变化。7.紫外线照射同样会影响4CL基因及黄酮含量和木质素含量。在紫外线照射下,基因Df4CL3和Df4CL4显著增加,尤其是Df4CL3。而黄酮类化合物增加显著,木质素增加平缓。一般而言,在紫外线照射下,保护植物体防止紫外线辐射的黄酮类物质会显著增加,这与我们得到的试验结果也相一致。8.本文成功构建了Df4CL2的原核表达体系表达出具有酶活性的重组蛋白,通过表达载体p ET28a-Df4CL2中的HIS标签成功纯化出重组蛋白。9.本文成功构建了植物表达载体pBI121-Df4CL1,通过浸花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化。利用PCR方法对转基因植株进行检测,获得纯合体转基因植株,并对黄酮化合物和木质素含量进行检测,结果显示,转基因植株中的含量明显高于野生型。
【关键词】：香鳞毛蕨 4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL) 功能验证 遗传转化
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2;S567.239
【目录】：

• 摘要12-14
• 英文摘要14-17
• 1 引言17-31
• 1.1 香鳞毛蕨的研究概述17-19
• 1.1.1 香鳞毛蕨简介17
• 1.1.2 香鳞毛蕨药用价值17-19
• 1.2 苯丙烷衍生物代谢途径的研究概述19-21
• 1.2.1 苯丙烷类代谢产物在植物体中的作用19-20
• 1.2.2 苯丙烷衍生物代谢途径20-21
• 1.3 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL) 研究进展21-24
• 1.3.1 4CL基因家族21-23
• 1.3.2 4CL同工酶研究23-24
• 1.3.3 4CL表达调控研究24
• 1.4 本实验中应用的主要技术24-28
• 1.4.1 转录组测序技术24-26
• 1.4.2 c DNA末端快速扩增技术(RACE)技术26-27
• 1.4.3 荧光定量PCR技术27-28
• 1.5 本研究目的、意义及技术路线28-31
• 1.5.1 研究目的、意义28-30
• 1.5.2 技术路线30-31
• 2 材料与方法31-56
• 2.1 试验材料31
• 2.2 香鳞毛蕨 4CL基因家族的克隆31-42
• 2.2.1 植物材料、菌种及质粒31
• 2.2.2 主要仪器31-32
• 2.2.3 主要药品及试剂32
• 2.2.4 缓冲液、主要试剂及培养基的配置32
• 2.2.5 香鳞毛蕨总RNA的提取32-33
• 2.2.6 RNA纯度及浓度检测33
• 2.2.7 香鳞毛蕨c DNA的合成33-34
• 2.2.8 香鳞毛蕨 4CL基因家族的电子克隆34-35
• 2.2.9 香鳞毛蕨 4CL基因家族c DNA 3′ 端片段的克隆35-38
• 2.2.10 香鳞毛蕨 4CL基因家族c DNA 5′端片段的克隆38-40
• 2.2.11 香鳞毛蕨 4CL基因家族开放阅读框架的克隆40-42
• 2.3 香鳞毛蕨 4CL基因家族的生物信息学分析42
• 2.4 香鳞毛蕨 4CL基因家族的特异性表达42-45
• 2.4.1 不同处理条件下香鳞毛蕨孢子体幼苗的培养42-43
• 2.4.2 香鳞毛蕨孢子体幼苗不同处理条件下RNA的提取43
• 2.4.3 c DNA第一链的合成43
• 2.4.4 香鳞毛蕨 4CL基因家族实时荧光定量PCR分析43-44
• 2.4.5 数据的统计分析及作图44-45
• 2.5 香鳞毛蕨总黄酮类化合物和木质素含量的测定45-47
• 2.5.1 试验材料45
• 2.5.2 主要仪器45
• 2.5.3 试验试剂45
• 2.5.4 香鳞毛蕨黄酮类化合物的测定45-47
• 2.5.5 香鳞毛蕨总木质素含量的测定47
• 2.6 香鳞毛蕨 4CL基因家族的原核表达及活性测定47-51
• 2.6.1 菌株和质粒47-48
• 2.6.2 原核表达载体构建48-49
• 2.6.3 目的蛋白的诱导表达49-50
• 2.6.4 SDS-PAGE检测表达蛋白50
• 2.6.5 重组蛋白酶活性测定50-51
• 2.6.6 香鳞毛蕨 4CL2蛋白的纯化51
• 2.7 香鳞毛蕨 4CL基因的真核表达及功能验证51-56
• 2.7.1 菌株及质粒51
• 2.7.2 常用试剂及培养基51-52
• 2.7.3 香鳞毛蕨Df4CL1基因植物表达载体的构建52
• 2.7.4 农杆菌菌液的制备52-53
• 2.7.5 Df4CL1基因对拟南芥的遗传转化53-54
• 2.7.6 Df4CL1基因转基因纯合植株的获得54
• 2.7.7 转基因拟南芥的PCR鉴定54-55
• 2.7.8 转基因拟南芥的代谢产物的总黄酮含量和木质素含量的测定55-56
• 3 结果与分析56-106
• 3.1 香鳞毛蕨 4CL基因家族的筛选56-57
• 3.2 香鳞毛蕨 4CL基因家族的克隆57-67
• 3.2.1 总RNA的提取57
• 3.2.2 Df4CL1基因全长克隆57-60
• 3.2.3 Df4CL2基因全长克隆60-62
• 3.2.4 Df4CL3基因全长克隆62-64
• 3.2.5 Df4CL4基因全长克隆64-66
• 3.2.6 Df4CL基因家族开放阅读框架的克隆66-67
• 3.3 香鳞毛蕨 4CL基因家族的核酸序列分析67-78
• 3.3.1 Df4CL基因家族cDNA序列同源性分析67-69
• 3.3.2 Df4CL基因家族密码子分析69-73
• 3.3.3 Df4CL基因家族表达预测73-78
• 3.3.4 Df4CL基因家族遗传进化分析78
• 3.4 香鳞毛蕨 4CL基因家族的蛋白序列分析及同源模建78-89
• 3.4.1 Df4CL家族蛋白一级结构的预测及分析78-80
• 3.4.2 Df4CL家族蛋白二级结构的预测及分析80-81
• 3.4.3 Df4CL蛋白疏水性分析81-82
• 3.4.4 Df4CL家族蛋白质的信号肽预测82-83
• 3.4.5 Df4CL家族蛋白卷曲螺旋预测分析83-84
• 3.4.6 Df4CL家族蛋白跨膜区分析84-85
• 3.4.7 Df4CL家族蛋白质糖基化位点分析85-86
• 3.4.8 Df4CL家族蛋白磷酸化位点预测86-87
• 3.4.9 Df4CL家族蛋白高级结构的预测及分析87-88
• 3.4.10 Df4CL家族蛋白遗传进化分析88-89
• 3.5 香鳞毛蕨 4CL基因家族的特异性表达89-92
• 3.5.1 Df4CL基因家族发育及不同部位的特异性表达89
• 3.5.2 Df4CL基因家族在温光诱导条件下的特异性表达89-91
• 3.5.3 Df4CL基因家族在紫外条件诱导下的特异性表达91-92
• 3.6 香鳞毛蕨总黄酮类化合物和总木质素含量的测定92-95
• 3.6.1 香鳞毛蕨不同部位的总黄酮类化合物含量92
• 3.6.2 香鳞毛蕨温度诱导条件下的总黄酮类化合物含量92-93
• 3.6.3 香鳞毛蕨紫外诱导条件下的总黄酮类化合物含量93
• 3.6.4 香鳞毛蕨不同部位的总木质素含量93-94
• 3.6.5 香鳞毛蕨温度诱导条件下的总木质素含量94-95
• 3.6.6 香鳞毛蕨紫外条件处理下的总木质素含量95
• 3.7 香鳞毛蕨 4CL基因家族的原核表达95-100
• 3.7.1 目的片段的扩增95-96
• 3.7.2 双酶切p ET-28a表达载体和目的基因96
• 3.7.3 p ET-28a表达载体和目的基因的连接96-97
• 3.7.4 SDS-PAGE检测表达重组蛋白97-98
• 3.7.5 不同IPTG浓度诱导香鳞毛蕨Df4CL2的表达98-99
• 3.7.6 不同IPTG浓度诱导香鳞毛蕨Df4CL2重组蛋白的活性测定99-100
• 3.7.7 Df4CL2重组蛋白的纯化100
• 3.8 Df4CL1基因的过表达体的构建及基因的功能验证100-106
• 3.8.1 含酶切位点的目的片段的扩增100-101
• 3.8.2 表达载体和目的基因的双酶切、连接及验证101-102
• 3.8.3 p BI121-Df4CL1转入农杆菌中的验证102
• 3.8.4 4CL过表达体拟南芥的获得102-104
• 3.8.5 Df4CL过表达体拟南芥的PCR鉴定104
• 3.8.6 4CL过表达拟南芥的总黄酮含量测定104-105
• 3.8.7 Df4CL1过表达体拟南芥的总木质素含量的测定105-106
• 4 讨论106-113
• 4.1 香鳞毛蕨 4CL基因家族的筛选106-107
• 4.2 香鳞毛蕨Df4CL基因家族成员的分析107-108
• 4.3 香鳞毛蕨 4CL基因家族的生物信息学分析108-109
• 4.4 香鳞毛蕨 4CL基因家族的原核表达109
• 4.5 香鳞毛蕨 4CL基因家族与总黄酮和木质素含量的关系109-113
• 5 结论113-114
• 6 创新点114-115
• 致谢115-116
• 参考文献116-129
• 攻读博士学位期间发表的学术论文129

【共引文献】

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