中华绒螯蟹螺原体磷脂代谢和精氨酸代谢中几种关键蛋白的功能研究

发布时间：2017-09-13 23:03

  本文关键词：中华绒螯蟹螺原体磷脂代谢和精氨酸代谢中几种关键蛋白的功能研究

  更多相关文章： 中华绒螯蟹螺原体 溶血磷脂酶 精氨酸 精氨酸脱亚胺酶系统 鲱精胺脱亚胺酶系统

【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的淡水养殖种类,近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高,由细菌、病毒和寄生虫等病原引起的各种病害日益严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。其中颤抖病是中华绒螯蟹中最为严重的病害,王文等的前期研究证明颤抖病的病原为一种特殊的细菌——螺原体,并正式命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)。S. eriocheiris不仅可以感染其自然界宿主中华绒螯蟹,还可以感染鸡胚和新生小鼠,引起小鼠白内障的病症,这与非凡螺原体(Spiroplasma mirum)可以引起啮齿类新生个体(包括新生小鼠)患白内障的病症非常相似。前期研究对S. eriocheiris生理生化性质、分类地位、病原检测、敏感药物的筛选和有效治疗药物的药代动力学进行了研究,以及分别构建了中华绒螯蟹螺原体侵染脊椎动物小鼠胚胎成纤维细胞(3T6细胞)模型和侵染无脊椎动物中华绒螯蟹血细胞模型。但是有关其分子生物学和主要蛋白功能方面的研究还处于前期阶段。因此,本博士学位论文在前期中华绒螯蟹螺原体基因组测序的基础上,利用比较基因组学,筛选和鉴定与中华绒螯蟹螺原体与致病相关的毒力因子、能量代谢以及侵染机制相关蛋白,这些工作为下一步研究中华绒螯蟹螺原体分子水平致病机制打下了坚实的基础。1.中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化以及酶活性质的分析通过对中华绒螯蟹螺原体基因组进行比对,发现中华绒螯蟹螺原体中仅含有一种磷脂酶——溶血磷脂酶(Lysophospholipase)并将之命名为SE-LsyoPLA,该序列全长927bp,编码一个308个氨基酸的蛋白,预测的蛋白分子量和等电点分别是35 kDa和pI 9.64。生物信息学分析,其氨基酸序列含有典型的GXSXG序列,三级结构中Ser-Asp-His三个氨基酸组成了催化三联体。对SE-LsyoPL基因进行成功克隆,点突变,进行原核表达,蛋白纯化。通过水解对硝基酚酯类p-NP palmitate实验分析重组蛋白的酶活性,结果显示SE-LsyoPL的最适的pH值为7.0左右,最适温度为30℃；在不同温度下的热稳定性分析结果表明,在0-30℃温度范围内酶活力较为稳定,当温度升高至50℃时,SE-LsyoPL已基本失活,说明SE-LsyoPL是一种温和的、中性的磷脂酶。考察不同金属离子对SE-LsyoPL酶活力的影响,Ca2+和Mn2+对酶的活性没有影响。本实验中还发现SE-LsyoPL对于长链脂肪酸的水解能力强,但是对于短链脂肪酸的水解能力弱。2.中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析利用已经纯化的SE-LsyoPL的重组蛋白成功地制备了SE-LsyoPL的多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗血清的效价,SE-LsyoPL抗血清的效价在1：70000左右。实验中利用超高速离心的方法成功的提取了S. eriocheiris膜蛋白,利用Western blotting分析表明,SE-LsyoPL是螺原体的一种膜蛋白。实验中采用已经成熟的S. eriocheiri体外侵染小鼠胚胎成纤维细胞(3T6细胞)的模型进行细胞学实验,采用抗体中和实验封闭S. eriocheiri表面的SE-LsyoPL酶位点来观察螺原体侵染能力的变化。土霉素法检测表明,当SE-LsyoPL抗体浓度为20 μg/ml时,螺原体在前期对3T6细胞的侵染率明显下降,螺原体侵染至48h后抗体中和实验组与螺原体侵染组中螺原体的侵染率没有显著差异(P0.05)；当SE-LsyoPL抗体浓度为2 μg/ml时,螺原体的侵染率并没有显著变化。采用流式细胞技术,进一步分析抗体中和实验组(SE-LsyoPL抗体浓度为20 μg/mL)和螺原体侵染组中细胞凋亡情况。螺原体侵染48h后,中和实验组中的早期细胞凋亡率要明显低于螺原体侵染组(P0.05),正常细胞的数量也明显的高于螺原体侵染组(P0.05),并且中和实验组中细胞形态较好。采用间接免疫荧光电镜技术,观察螺原体对3T6细胞的侵染情况,结果表明在接种螺原体48h后抗体中和实验组中螺原体的分布主要成零星的点状分布,主要在宿主细胞的胞膜上分布且绿色荧光微弱。而在螺原体侵染组中可以看到大量螺原体侵染到宿主细胞内部并成团状分布,形成包涵体且荧光强度高,表明螺原体的侵染要明显的高于中和实验组。研究表明,当螺原体表面的SE-LsyoPL酶位点被抗体封闭时,螺原体的侵染率明显下降。3.中华绒螯蟹螺原体的生长特性以及对精氨酸利用的研究本实验中首先利用了一种简单的培养基R8-1对S. eriocheiris生长特性进行研究,研究表明螺原体能很好生长于R8-1培养基中,S. eriocheiris的最适生长温度为30-32℃,最高生长温度约42℃。S. eriocheiris最适pH为7.2-7.6,最低耐受约pH约5.0,最高耐受pH高达10.0。培养基中添加20 mM/L精氨酸时,发现螺原体的生长速度要明显高于没有添加精氨酸的培养基中的生长速度,继续培养时,添加精氨酸组的平台期的要明显变长。高效液相色谱(HPLC)对螺原体利用精氨酸的情况进行分析,在培养的前期螺原体并不能利用精氨酸,而到了平台期以后螺原体才能逐渐的开始利用精氨酸,并且此时培养基中瓜氨酸和鸟氨酸两种氨基酸呈明显上升趋势,说明此时螺原体能够很好的利用精氨酸作为能源物质。4.中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶(Arginine dei mi nase, ADI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能分析通过基因组学研究表明,S. eriocheiris基因组中含有一条典型的精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase, ADI)系统,并包含完整的基因簇,通过生物信息学分析表明ADI系统含有精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),精氨酸鸟氨酸转运基因(AOA)和氨甲酰激酶(CK)四个酶。首先对ADI系统中三种关键的蛋白——精氨酸脱亚胺酶(ADI)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)进行基因进行克隆、点突变、重组蛋白原核表达、蛋白纯化以及多克隆抗体的制备。通过Western blotting分析发现CK和OTC两种酶是在S. eriocheiris的细胞膜上具有分布。在不同pH、不同温度、培养基中添加精氨酸和不同浓度葡萄糖的条件下,利用RealTime-PCR和Western blotting技术,从分子层面上研究S. eriocheiris在不同环境条件下ADI系统关键酶的基因水平和蛋白水平表达量变化情况,结果表明ADI系统在高温和酸性(pH=5)等不良的环境下,ADI系统中基因的表达量明显上调,蛋白的表达量显著升高。但在培养基中高浓度糖类时,ADI系统却会被明显的抑制。综合结果表明精氨酸代谢系统在S. eriocheiris能量代谢和抗逆过程中起到重要的作用。5.中华绒螯蟹螺原体鲱精胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase, AgDI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能的分析研究发现S. eriocheiris基因组中还含有一条完整的鲱精胺脱亚胺(Agmatine deiminase, AgDI)系统,基因簇中含有完整的基因包括鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)、胍丁胺-腐胺转运蛋白(A/P)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)。首先对AgDI系统中两种关键的蛋白鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)进行基因克隆、点突变、重组蛋白原核表达、蛋白纯化以及多克隆抗体的制备。利用RealTime-PCR和Western blotting方法从分子层面上研究S. eriocheiris在不同环境条件下(不同pH环境、不同温度及不同浓度葡萄糖条件下)AgDI系统关键酶的基因水平和蛋白水平表达量变化,结果表明AgDI系统在酸性(pH=5)不良的环境下,AgDI系统中基因的表达量明显上调,蛋白的表达量显著升高,但是在高温情况下,AgDI酶的表达量并没有明显升高,表明AgDI系统在高温下没有被明显的激活。在当培养基中高浓度糖类存在的条件下,AgDI系统却会被明显的抑制。结果表明鲱精胺脱亚胺酶系统在S. eriocheiris能量代谢和抵抗pH过程中起到重要的作用,但是在高温条件下没有明显的变化。
【关键词】：中华绒螯蟹螺原体 溶血磷脂酶 精氨酸 精氨酸脱亚胺酶系统 鲱精胺脱亚胺酶系统
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945
【目录】：

• 摘要3-7
• Abstract7-17
• 第一章 绪论17-41
• 1.1 螺原体的发现、分类、生物学特性和致病机理的研究17-23
• 1.1.1 螺原体的发现与相关报道17-19
• 1.1.2 螺原体的基本生物学特性19-21
• 1.1.3 螺原体的分布及其致病性21-22
• 1.1.4 螺原体致病机制的研究进展22-23
• 1.2 中华绒螯蟹螺原体的研究进展23-26
• 1.2.1 中华绒螯蟹颤抖病的流行病学调查23
• 1.2.2 中华绒螯蟹螺原体的研究进展23-26
• 1.3 柔膜体纲细菌基因组学研究进展26-32
• 1.3.1 螺原体比较基因组学研究28-29
• 1.3.2 螺原体的基本代谢特征29-32
• 1.4 磷脂酶的研究进展32-35
• 1.4.1 磷脂酶的分类32
• 1.4.2 磷脂酶的致病作用机理32
• 1.4.3 溶血磷脂酶32-35
• 1.5 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统和精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,AgDI)系统的研究进展35-39
• 1.5.1 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统的生理功能35-37
• 1.5.2 精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统的致病作用37-38
• 1.5.4 鲱精胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系统38-39
• 1.6 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线39-41
• 第二章 中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化以及酶活性质的分析41-62
• 2.1 材料41-45
• 2.1.1 主要设备41-42
• 2.1.2 主要试剂42-44
• 2.1.3 引物设计与合成44-45
• 2.2 方法45-69
• 2.2.1 序列分析45-115
• 2.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取115-45
• 2.2.3 SE-LsyoPL基因PCR扩增45-46
• 2.2.4 SE-LsyoPL基因与pUC载体的连接46
• 2.2.5 pUC-SE-LsyoPL连接产物的转化46
• 2.2.6 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析46
• 2.2.7 点突变实验46-48
• 2.2.8 构建表达载体48
• 2.2.9 表达重组蛋白及鉴定48-95
• 2.2.10 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功95-49
• 2.2.11 Ni-NTA Agarose亲和层析49-50
• 2.2.12 中华绒螯蟹溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)的活力测定和蛋白含量测定50
• 2.2.13 酶学性质的测定50-51
• 2.2.14 重组酶的底物特异性51-69
• 2.3 结果69-59
• 2.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取、SE-LsyoPL基因PCR扩增及序列分析115-55
• 2.3.2 中华绒螯蟹螺原体SE-LsyoPL基因的点突变55
• 2.3.3 原核表达载体的构建55-56
• 2.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定56
• 2.3.5 重组中华绒螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的酶学性质56-58
• 2.3.6 重组中华绒螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的底物特异性58-59
• 2.4 讨论59-62
• 第三章 中华绒螯蟹螺原体溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析62-79
• 3.1 主要实验材料、仪器与试剂62-64
• 3.1.1 实验材料62-63
• 3.1.2 主要仪器和耗材63
• 3.1.3 主要试剂配方63-64
• 3.2 实验方法64-69
• 3.2.1 制备多克隆抗体与其效价检测64-65
• 3.2.2 Western blotting分析65
• 3.2.3 中华绒螯蟹螺原体总蛋白和膜蛋白的提取65-66
• 3.2.4 3T6细胞细胞培养与侵染66-67
• 3.2.5 SE-LsyoPL抗体中和实验67
• 3.2.6 间接免疫荧光法标记定位67-68
• 3.2.7 土霉素法检测侵染率68
• 3.2.8 利用流式细胞技术检测螺原体感染后3T6细胞的细胞凋亡68-69
• 3.3 结果69-76
• 3.3.1 SE-LsyoPL重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测69-70
• 3.3.2 螺原体总蛋白、膜蛋白和细胞质蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析70-72
• 3.3.3 土霉素法检测中华绒螯蟹螺原体S.eriocheiris侵染比例以及中和实验侵染结果72-73
• 3.3.4 3T6细胞细胞培养与侵染结果73-75
• 3.3.5 间接免疫荧光法标记定位结果75-76
• 3.4 讨论76-79
• 第四章 中华绒螯蟹螺原体生长特性及对精氨酸利用的研究79-92
• 4.1 主要实验材料、仪器与试剂79-80
• 4.1.1 实验材料79
• 4.1.2 主要仪器和耗材79-80
• 4.1.3 主要试剂配方80
• 4.2 实验方法80-83
• 4.2.1 高效液相色谱法测定中华绒螯蟹螺原体对精氨酸的利用情况80-81
• 4.2.2 中华绒螯蟹螺原体计数--颜色改变单位法(colour change unit,简称CCU)81-82
• 4.2.3 中华绒螯蟹螺原体生长曲线测定82
• 4.2.4 温度对中华绒螯蟹螺原体生长的影响82
• 4.2.5 pH对中华绒螯蟹螺原体生长的影响82
• 4.2.6 培养基中添加精氨酸对对中华绒螯蟹螺原体生长的影响82-83
• 4.3 结果83-90
• 4.3.1 R8-1培养基中温度对中华绒螯蟹螺原体生长的影响83
• 4.3.2 pH对中华绒螯蟹螺原体生长的影响83-84
• 4.3.3 R8-1培养基中添加精氨酸对中华绒螯蟹螺原体生长的影响84-85
• 4.3.4 高效液相色谱法测定中华绒螯蟹螺原体对精氨酸的利用情况85-90
• 4.4 讨论90-92
• 第五章 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能的分析92-114
• 5.1 材料93
• 5.1.1 实验仪器93
• 5.1.2 实验试剂93
• 5.2 实验方法93-98
• 5.2.1 序列分析93
• 5.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取93
• 5.2.3 螺原体培养93-94
• 5.2.4 精氨酸脱亚胺酶中关键基因——精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)的PCR扩增94-95
• 5.2.5 精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因与pUC19载体的连接95
• 5.2.6 pUC-ADI,OTC和CK连接产物的转化95
• 5.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析95
• 5.2.8 点突变实验95
• 5.2.9 表达载体的构建95
• 5.2.10 重组蛋白的表达与鉴定95
• 5.2.11 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功95
• 5.2.12 Ni-NTA Agarose亲和层析95
• 5.2.13 多克隆抗体的制备与效价检测95
• 5.2.14 中华绒螯蟹螺原体螺原体总蛋白和膜蛋白的提取95
• 5.2.15 RNA提取95-96
• 5.2.16 去除DNA96-97
• 5.2.17 反转录97
• 5.2.18 Real Time PCR反应97-98
• 5.3 实验结果98-111
• 5.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取,精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因PCR扩增及序列分析98-102
• 5.3.2 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中基因的点突变102
• 5.3.3 原核表达载体的构建102
• 5.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定102-103
• 5.3.5 精氨酸脱亚胺酶(ADI),鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测及Western blotting分析103-105
• 5.3.6 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中基因Real time RTPCR分析105-110
• 5.3.7 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中关键酶在不同条件下蛋白表达量的分析110-111
• 5.4 讨论111-114
• 第六章 中华绒螯蟹螺原体鲱精胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系统中关键基因的生物信息学分析及其克隆、表达纯化和功能的分析114-128
• 6.1 材料115
• 6.1.1 实验仪器93-115
• 6.1.2 实验试剂115
• 6.2 实验方法115-117
• 6.2.1 序列分析115
• 6.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取115
• 6.2.3 螺原体培养115
• 6.2.4 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)通路中关键基因——鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)的PCR扩增115-116
• 6.2.5 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)与pUC19载体的连接116
• 6.2.6 pUC-AgDI和PTC连接产物的转化116
• 6.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析116
• 6.2.8 点突变实验116
• 6.2.9 表达载体的构建116
• 6.2.10 重组蛋白的表达与鉴定116
• 6.2.11 Western blot分析蛋白表达结果确定目的蛋白诱导表达成功116-117
• 6.2.12 Ni-NTA Agarose亲和层析117
• 6.2.13 多克隆抗体的制备与效价检测117
• 6.2.14 RNA提取117
• 6.2.15 去除DNA117
• 6.2.16 测量RNA浓度117
• 6.2.17 反转录117
• 6.2.18 Real Time PCR反应117
• 6.3 实验结果117-126
• 6.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取,鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)基因PCR扩增及序列分析117-120
• 6.3.2 中华绒螯蟹螺原体AgDI系统中基因的点突变120
• 6.3.3 原核表达载体的构建120
• 6.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定120-121
• 6.3.5 鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰转移酶(PTC)重组蛋白多克隆抗体制备与效价检测121-122
• 6.3.6 中华绒螯蟹螺原体鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)系统中基因Real timeRT-PCR分析122-125
• 6.3.7 中华绒螯蟹螺原体精氨酸脱亚胺酶系统中关键酶在不同条件下蛋白表达量的分析125-126
• 6.4 讨论126-128
• 全文总结128-132
• 参考文献132-146
• 附录A146-148
• 在读期间发表的学术论文及研究成果148-149
• 致谢149-150

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵，

本文编号：846402