女贞子及其成分对MC3T3-E1细胞增殖和OPG表达影响及其机制研究

发布时间：2017-09-18 01:40

  本文关键词：女贞子及其成分对MC3T3-E1细胞增殖和OPG表达影响及其机制研究

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【摘要】：女贞子滋补肝肾之阴,具有强筋健骨之效。熊果酸和齐墩果酸是女贞子中含量较高的主要有效成分,其中熊果酸已被证明具有成骨作用。本试验是通过测定女贞子及其成分熊果酸和齐墩果酸对成骨样细胞MC3T3-E1增殖分化和OPG/RANKL/RANK系统的影响来探讨女贞子及其成分的成骨作用及其作用机制。 试验方法：本试验选用MC3T3-E1细胞作为模型细胞,不同浓度的女贞子水提液、熊果酸和齐墩果酸作用于细胞48h、72h和96h后,根据不同试验的要求选择合适的浓度和时间点检测细胞活性,ALP活性,OPG和RANKL基因和蛋白表达及细胞通路的蛋白磷酸化。本试验中通过CCK-8法测定细胞活性,ELISA法测定细胞上清OPG和tANKL蛋白含量,FQ-PCR测定OPG和RANKL mRNA表达,以及Western Blot法测定细胞蛋白的表达。 试验结果：不同浓度的女贞子水提液作用于细胞48h,72h和96h后,细胞活性率显著上升,尤其在中低浓度和较长时间作用下。一定浓度的熊果酸和齐墩果酸作用于细胞48h和72h后,熊果酸和齐墩果酸显著促进细胞增殖,且相对来说熊果酸的促细胞增殖作用更加显著。一定浓度的女贞子,熊果酸或齐墩果酸可以促进MC3T3-E1细胞ALP分泌。一定浓度的女贞子及其成分作用于细胞48h和72h后,除最高浓度组外,女贞子、熊果酸和齐墩果酸可以促进MC3T3-E1细胞上清OPG和RANKL蛋白的分泌。同时一定浓度的女贞子及其成分在作用细胞48h和72h时,可以促进细胞OPG和IANKL mRNA的表达。10-5mg/ml浓度的女贞子水提液,1×10-4gM浓度的熊果酸及1×10-3μM浓度的齐墩果酸可以上调OPG蛋白的表达,此时女贞子和齐墩果酸能够下调细胞RANKL蛋白的表达。一定浓度的女贞及其成分,一定浓度的抑制剂(20μM),药物与抑制剂混合培养液分别作用于MC3T3-E1细胞72h后,抑制剂ICI、RO、SB、LY对MC3T3-E1的细胞活性有显著抑制作用,所有抑制剂ICI、RO、PDTC、PD、SB、SP和LY均对细胞OPG分泌有显著抑制作用。女贞子、熊果酸和齐墩果酸的促MC3T3-E1细胞增殖和促OPG蛋白分泌作用可以受到所有抑制剂影响,但所用模式各不相同。女贞子和熊果酸可以上调磷酸化的p-ERK, p-p38,下调p-JNK,女贞子上调p-AKT;齐墩果酸上调p-AKT,F调p-ERK, p-p38, p-JNK. 结论：女贞子水提液、熊果酸和齐墩果酸可以促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化,细胞OPG和RANKL mRNA和蛋白表达。女贞子水提液对成骨细胞的影响作用体现了女贞子“功缓”的特点。其中熊果酸是女贞子促细胞增殖和OPG表达的主要成分,而女贞子的促细胞分化和RANKL分泌的作用与熊果酸和齐墩果酸有关。女贞子及其成分的促细胞增殖和促细胞OPG分泌作用与ER、PKC、NF-κB、MAPK和AKT信号通路有关,但通路作用方式有差异。女贞子、熊果酸和齐墩果酸对MAPK和AKT通路蛋白及通路蛋白的磷酸化具有不同作用,ERK和p38MAPK通路是齐墩果酸区别与女贞子和熊果酸的关键信号通路。
【关键词】：女贞子 熊果酸 齐墩果酸 细胞增殖 骨保护素OPG
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S853.7
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 中英文检索表8-11
• 第一章 引言11-26
• 1.1 骨质疏松研究进展11-14
• 1.2 女贞子研究进展14-16
• 1.3 成骨细胞研究进展16-18
• 1.4 OPG/RANK/RANKL系统研究进展18-20
• 1.5 成骨细胞信号通路研究进展20-23
• 1.6 信号转导通路研究方法23-24
• 1.7 研究内容和技术路线24-25
• 1.8 研究目的与意义25
• 1.9 研究目标25-26
• 第二章 女贞子及其成分对MC3T3-E1细胞增殖及分化的影响26-39
• 2.1 引言26
• 2.2 材料26-28
• 2.3 方法28-30
• 2.4 试验结果30-34
• 2.5 讨论34-38
• 2.6 本章小结38-39
• 第三章 女贞子及其成分对MC3T3-E1细胞OPG及RANKL基因和蛋白表达的影响39-60
• 3.1 引言39
• 3.2 材料39-42
• 3.3 方法42-46
• 3.4 试验结果46-53
• 3.5 讨论53-58
• 3.6 本章小结58-60
• 第四章 女贞子及其成分对MC3T3-E1增殖影响的通路研究60-74
• 4.1 引言60
• 4.2 材料60
• 4.3 方法60-62
• 4.4 试验结果62-70
• 4.5 讨论70-73
• 4.6 本章小结73-74
• 第五章 女贞子及成分对MC3T3-E1细胞OPG影响的通路研究74-86
• 5.1 引言74
• 5.2 材料74
• 5.3 方法74-75
• 5.4 试验结果75-84
• 5.5 讨论84-85
• 5.6 本章小结85-86
• 第六章 女贞子及其成分对MAPK、AKT通路蛋白磷酸化作用86-94
• 6.1 引言86
• 6.2 材料86-87
• 6.3 方法87
• 6.4 试验结果87-91
• 6.5 讨论91-93
• 6.6 本章小结93-94
• 第七章 结论94-95
• 第八章 创新点95-96
• 参考文献96-109
• 致谢109-111
• 个人简介111

【参考文献】

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