鱼类GABA受体与相关药物作用机理研究及其纯化分离

发布时间：2017-09-19 18:21

  本文关键词：鱼类GABA受体与相关药物作用机理研究及其纯化分离

  更多相关文章： γ-氨基丁酸A型受体 氟虫腈 1 4-苯二氮卓化合物RO7 同源建模 去污剂 生物模板法 琼脂糖-二氧化硅复合粒子 亲和纯化

【摘要】：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是脊椎动物和无脊椎动物体内重要的抑制性神经递质,它的传递作用是由GABA受体介导的。GABA大部分作用是通过GABAA受体介导的。GABAA受体不仅是治疗人的癫痫,失眠,精神分裂症,酒精中毒,帕金森综合症等神经系统疾病的医药作用靶点,而且是氟虫腈,林丹、硫丹等有机氯类,及阿维菌素类等杀虫剂的作用靶标。氟虫腈(Fipronil)是一种高效的的苯基吡唑类杀虫剂,为GABAA受体拮抗剂,通过作用于GABAA受体,阻断氯离子通道,导致神经信号的损失、过度兴奋及死亡。氟虫腈对不同生物具有毒性差异,对蝇类、鞘翅目及鳞翅目等系列害虫具有很高的杀虫活性,对哺乳动物GABAA受体具有较低的亲和力,所以对哺乳动物的毒性非常低。但氟虫腈对某些非靶标生物,如鱼类等水生生物的毒性很高,鱼类是水生生态系统中的重要组成部分,因此氟虫腈对鱼类的毒性机理研究及其重要。本论文的主要创新点为:针对氟虫腈对鱼类高毒问题,①本论文首次利用荧光探针法探索了鱼类GABAA受体与农药氟虫腈及1,4-苯二氮卓类药物RO7的相互作用;②利用计算机模拟方法研究了氟虫腈与鱼类GABAA受体的相互作用,即采用同源模建的方法构建了斑马鱼α1β2γ2型GABAA受体模型,运用分子对接考察氟虫腈(及其代谢物)与鱼类GABAA受体间的作用模式,阐明了氟虫腈产生鱼毒的机理。③利用生物模板法,合成了粒径分布1.5μm非磁性及磁性单分散二氧化硅,进一步采用反相悬浮包埋法成功制备琼脂糖-二氧化硅亲和层析载体。④利用氟虫腈和RO7作为亲和配基制成亲和层析色谱柱,采用亲和层析法初步分离了鱼类GABAA受体,探索了两种亲和柱对鱼类GABAA受体分离的条件。本论文取得的主要研究结论如下:1)1,4-苯二氮卓药物制备方面:1,4-苯二氮卓药物在脊椎动物GABAA受体研究中具有极大的重要性,本课题设计并合成了1,4-苯二氮卓药物RO7及洗脱剂氟西泮,对其合成条件进行了详细的探讨,中间产物及最终产品的结构均通过核磁共振氢谱,红外光谱、熔点仪等测试手段确证。2)荧光探针法研究1,4-苯二氮卓药物与鱼类GABAA受体相互作用方面:用异硫氰基荧光素(fitc)标记苯二氮卓化合物ro7制备了ro-fitc(rf)荧光探针,研究了该荧光探针与鱼脑内gabaa受体的相互作用,同时研究了gaba对ro7与gabaa受体之间相互作用的影响。结果显示,所制备的荧光探针rf与鱼脑内gabaa受体有特异性结合,ro7与受体的亲和解离常数kd值为67±5nmol/l,最大结合量[rt]值为13.8±1.8pmol/mgprotein。gaba能促进ro7与gabaa受体的结合。以上说明鱼类gabaa受体与哺乳动物结构和功能上相似。3)荧光探针法研究氟虫腈与鱼类gabaa受体相互作用方面:以异硫氰酸荧光素(fitc)标记氟虫腈(fipronil)制备了fipronil-fitc(ff)荧光探针,研究了该荧光探针与鱼脑内gabaa受体的相互作用。结果显示,所制备的荧光探针ff与鱼脑内gabaa受体有特异性结合,fipronil与受体的亲和解离常数kd值为346±6nmol/l,最大结合量[rt]值为40.6±3.5pmol/mgprotein。与哺乳动物相比,fipronil对鱼类和昆虫gabaa受体亲和力较高,这可能是fipronil对鱼类毒性高于哺乳动物毒性的一方面原因。4)计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类gabaa受体相互作用方面:为了研究氟虫腈对鱼类的毒性机理,采用计算机模拟的方法,以烟碱型乙酰胆碱受体为模板,同源建模构建了斑马鱼α1β2γ2型gabaa受体模型,通过分子对接和分子动力学模拟,考察氟虫腈(及其代谢物)与gabaa受体间的分子相互作用。发现氟虫腈与斑马鱼gabaa受体离子通道内侧的2′,6′和9′的氨基酸有强烈的结合作用,其中氟虫腈苯环及cf3位于胞内区一边,吡唑环与socf3位于胞外区一边,特别是氟虫腈与6′位亲水性氨基酸残基苏氨酸形成3条氢键,这对与氟虫腈与鱼类gabaa受体的结合非常关键,氟虫腈与鱼类gabaa受体间的强烈的氢键作用可能是氟虫腈对鱼类产生高毒的原因。同时考察了氟虫腈在环境中主要的四种代谢产物与斑马鱼gabaa受体的相互作用,对接显示四种代谢产物与受体的cdocker相互作用能均比氟虫腈低,特别是mb46136和fipronil-desulfinyl。说明氟虫腈代谢产物的对鱼类的毒性都强于氟虫腈,具有较高的环境风险。以烟碱型乙酰胆碱受体为模板,同时同源建模构建了大鼠α1β2γ2型gabaa受体模型,通过分子对接和分子动力学模拟,发现氟虫腈与大鼠gabaa受体仅形成一条氢键,而氟虫腈与斑马鱼gabaa受体6′位亲水性氨基酸残基苏氨酸形成3条氢键,以上从理论上说明了氟虫腈对鱼类高毒而对哺乳动物低毒的原因。5)亲和层析载体制备方面:利用生物模板法,合成了粒径分布1.5μm的单分散性的二氧化硅、实心磁性二氧化硅及空心磁性二氧化硅,并采用反相悬浮包埋法成功制备琼脂糖-二氧化硅复合粒子。利用四亚甲基乙二醇缩水甘油醚作为环氧活化剂,用于活化琼脂糖-二氧化硅复合粒子,最终确定了环氧活化剂活化介质的最佳反应条件,最终得到介质的环氧基密度达65.3μmol/g胶,为成功制备分离鱼类GABAA受体的亲和介质奠定了基础。6)去污剂对鱼类GABAA受体溶出效率方面:在对鱼类GABAA受体分离时,比较了4%CHAPS,2%Sodium Deoxycholate,2%OCTG,1%Triton X-100,1%Nonidet P-40及0.5%Lubrol-PX等六种去污剂对GABAA受体蛋白溶出量,结果显示1%Nonidet P-40对受体蛋白溶出量最高,为729μg/m L。7)亲和层析柱的制备及鱼类GABAA受体分离方面:分别以氟虫腈和1,4-苯二氮卓化合物RO7为亲和配基,琼脂糖-二氧化硅复合粒子为载体,制备了两种亲和柱;比较了两种亲和柱分离鱼类GABAA受体亚基的区别,其中经RO7亲和柱可分离出4条条带,分子量分别为56,54,43及37 kD,而氟虫腈亲和柱仅分离出分子量分别为44 kD和55 kD两条条带,初步证明苯二氮卓类化合物RO7与氟虫腈作用于GABAA受体的不同亚基,这是造成氟虫腈对鱼类产生毒性的原因。
【关键词】：γ-氨基丁酸A型受体 氟虫腈 1 4-苯二氮卓化合物RO7 同源建模 去污剂 生物模板法 琼脂糖-二氧化硅复合粒子 亲和纯化
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941;S482.3
【目录】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-15
• 缩略语(Abbreviations)15-17
• 第一章 前言17-21
• 1.1 氟虫腈对人畜的安全性及对昆虫的高效性17-18
• 1.2 氟虫腈对鱼类等水生生物的严重毒性18
• 1.3 1,4-苯二氮卓类化合物在鱼类GABAA受体研究中的应用18
• 1.4 1,4-苯二氮卓化合物在分离哺乳动物GABAA受体的应用18-19
• 1.5 1,4-苯二氮卓化合物荧光探针与哺乳动物GABAA受体相互作用研究19
• 1.6 配体-受体相互作用的计算机模拟19
• 1.7 本课题的研究意义19-21
• 第二章 文献综述21-44
• 2.1 GABA受体分类21
• 2.2 GABAA受体的分子结构和分布特点21-24
• 2.2.1 GABAA受体分子结构21-23
• 2.2.2 GABAA受体亚单位及分布23
• 2.2.3 GABAA受体的活性部位23-24
• 2.3 氟虫腈及对不同生物的毒性差异24-25
• 2.4 GABAA受体与配体的相互作用的研究手段25-35
• 2.4.1 放射性标记法研究受体与配体的相互作用25-28
• 2.4.2 荧光探针法研究受体与配体的相互作用28-31
• 2.4.3 计算模拟技术研究GABAA受体与配体的相互作用31-32
• 2.4.4 相关计算机模拟方法简介32-35
• 2.4.4.1 同源模建（homology modeling）32-33
• 2.4.4.2 分子动力学33-35
• 2.4.4.3 分子对接35
• 2.5 GABAA受体分离纯化研究35-42
• 2.5.1 去污剂对GABAA受体蛋白分离的影响36-39
• 2.5.2 GABAA受体的纯化方法39-42
• 2.5.2.1 亲和层析法在哺乳动物GABAA受体纯化中的应用39-40
• 2.5.2.2 其他分离方法在哺乳动物GABAA受体纯化中的应用40-42
• 2.5.2.3 亲和层析法在鱼类GABAA受体纯化中的应用42
• 2.6 小结42-44
• 第三章 设计思想与合成路线44-51
• 3.1 本研究的总体设计思想44-45
• 3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7及洗脱剂合成路线设计45-46
• 3.3 荧光探针合成路线设计46-47
• 3.3.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7荧光探针合成路线设计46
• 3.3.2 氟虫腈荧光探针合成路线设计46-47
• 3.4 计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类GABAA受体的相互作用设计47
• 3.5 亲和基质琼脂糖-二氧化硅亲和载体的制备路线设计47-48
• 3.5.1 非磁性二氧化硅微球路线设计47-48
• 3.5.2 实心和空心磁性二氧化硅微球的制备路线设计48
• 3.5.3 琼脂糖-二氧化硅亲和载体制备过程设计48
• 3.6 亲和层析介质的制备48-49
• 3.6.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7亲和层析介质的制备路线设计48-49
• 3.6.2 氟虫腈亲和层析介质的制备路线设计49
• 3.7 鱼类GABAA受体的亲和分离实验设计49-51
• 第四章 1,4-苯二氮卓类化合物RO7及氟西泮的合成51-68
• 4.1 实验部分52-57
• 4.1.1 实验试剂52
• 4.1.2 实验仪器与设备52
• 4.1.3 实验方法52-57
• 4.1.3.1 N-苄氧羰基3碘乙胺的制备52-53
• 4.1.3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7的制备53-56
• 4.1.3.3 1.4-苯二氮卓化合物Ⅱ（氟西泮）的制备56-57
• 4.2 结果与讨论57-67
• 4.2.1 化合物最优合成条件筛选57-63
• 4.2.1.1 化合物3最优制备条件筛选57-58
• 4.2.1.2 化合物4最优制备条件筛选58-60
• 4.2.1.3 N-苄氧羰基3碘乙胺最优制备条件筛选60-61
• 4.2.1.4 1,4-苯二氮卓化合物RO7盐酸盐最优制备条件筛选61
• 4.2.1.5 1,4-苯二氮卓化合物Ⅱ氟西泮最优制备条件筛选61-63
• 4.2.2 化合物图谱分析63-67
• 4.2.2.1 N-苄氧羰基3碘乙胺的红外光谱图谱分析63-64
• 4.2.2.2 化合物1的红外光谱图谱分析64
• 4.2.2.3 化合物2的红外光谱图谱分析64-65
• 4.2.2.4 化合物3的红外光谱图谱分析65-66
• 4.2.2.5 1,4-苯二氮卓化合物RO7的红外光谱图谱分析66-67
• 4.2.2.6 1,4-苯二氮卓化合物氟西泮红外光谱图谱分析67
• 4.3 结论67-68
• 第五章 荧光探针法研究 1,4-苯二氮卓化合物与鱼类GABAA受体的相互作用68-79
• 5.1 实验部分69-72
• 5.1.1 实验动物69
• 5.1.2 实验试剂69
• 5.1.3 实验仪器与设备69
• 5.1.4 实验方法69-72
• 5.1.4.1 RF荧光探针的制备69-70
• 5.1.4.2 组织膜受体制剂的制备70
• 5.1.4.3 荧光配体RF与组织膜受体制剂的结合实验70-72
• 5.2 结果与讨论72-78
• 5.2.1 产物的结构鉴定72
• 5.2.2 光学性能检测分析72-74
• 5.2.3 不同溶剂体系对荧光配体荧光强度的影响74-75
• 5.2.4 受体与配体结合的动力学分析75-77
• 5.2.5 GABA竞争性结合实验分析77-78
• 5.3 结论78-79
• 第六章 荧光探针法研究氟虫腈与鱼类GABAA受体的相互作用79-90
• 6.1 实验部分80-82
• 6.1.1 实验动物80
• 6.1.2 实验试剂80
• 6.1.3 实验仪器与设备80-81
• 6.1.4 实验方法81-82
• 6.1.4.1 FF荧光探针的制备81
• 6.1.4.2 受体膜制剂的制备81-82
• 6.1.4.3 荧光配体FF与受体膜制剂的结合实验82
• 6.2 结果与讨论82-89
• 6.2.1 产物的结构鉴定82-83
• 6.2.2 光学性能检测分析83-85
• 6.2.3 不同溶剂体系对荧光配体荧光强度的影响85-86
• 6.2.4 受体与配体结合的动力学分析86-89
• 6.3 结论89-90
• 第七章 计算机模拟技术研究氟虫腈与鱼类GABAA受体的相互作用90-111
• 7.1 实验部分91-93
• 7.1.1 同源模建91-93
• 7.1.1.1 选择序列91-92
• 7.1.1.2 选择模板92
• 7.1.1.3 亚基构建92
• 7.1.1.4 将模型进行有效组合92
• 7.1.1.5 模型的优化与修正92
• 7.1.1.6 氟虫腈与受体模型结合活性.袋的确定92-93
• 7.1.1.7 氟虫腈及氟虫腈荧光探针分子与受体模型对接93
• 7.2 结果与讨论93-109
• 7.2.1 斑马鱼GABAA受体同源建模93-96
• 7.2.2 氟虫腈及氟虫腈荧光探针分子与斑马鱼GABAA受体模型的对接96-100
• 7.2.2.1 氟虫腈与斑马鱼GABAA受体模型的对接96-98
• 7.2.2.2 氟虫腈荧光探针分子与受体模型的对接98-100
• 7.2.3 氟虫腈代谢产物与斑马鱼GABAA受体模型的对接分析100-106
• 7.2.4 氟虫腈与大鼠GABAA受体相互作用106-109
• 7.2.4.1 哺乳动物大鼠GABAA受体同源建模106-108
• 7.2.4.2 氟虫腈与大鼠GABAA受体模型的对接108-109
• 7.3 结论109-111
• 第八章 琼脂糖-二氧化硅亲和载体的制备111-134
• 8.1 实验部分112-116
• 8.1.1 实验试剂112
• 8.1.2 实验仪器与设备112
• 8.1.3 实验方法112-116
• 8.1.3.1 无磁性实心单分散二氧化硅微球的制备112-113
• 8.1.3.2 实心磁性二氧化硅微球的制备113
• 8.1.3.3 空心磁性二氧化硅微球的制备113
• 8.1.3.4 琼脂糖-二氧化硅复合粒子的制备113-114
• 8.1.3.5 琼脂糖-二氧化硅复合粒子表面的环氧化114
• 8.1.3.6 反应温度对环氧基密度的影响114
• 8.1.3.7 反应时间对环氧基密度的影响114
• 8.1.3.8 环氧活化剂用量对环氧基密度的影响114-115
• 8.1.3.9 DMSO及NaOH浓度对环氧基密度的影响115
• 8.1.3.10环氧基密度的测定115
• 8.1.3.11样品表征115-116
• 8.2 结果与讨论116-133
• 8.2.1 非磁性单分散二氧化硅微球的制备过程116-120
• 8.2.1.1 非磁性二氧化硅微球的形成机理116
• 8.2.1.2 非磁性二氧化硅微球形貌分析116-120
• 8.2.2 磁性二氧化硅微球的制备过程机理分析120-128
• 8.2.2.1 磁性二氧化硅微球形貌及结构表征121-128
• 8.2.3 琼脂糖-二氧化硅复合粒子的形貌表征128-129
• 8.2.4 琼脂糖-二氧化硅复合粒子表面琼脂糖环氧活化剂活化效率的影响因素分析129-133
• 8.2.4.1 DMSO和NaOH浓度对环氧活化剂活化率的影响129-130
• 8.2.4.2 反应温度对环氧活化剂活化率的影响130-131
• 8.2.4.3 反应时间对环氧活化剂活化率的影响131-132
• 8.2.4.4 活化剂浓度对环氧活化剂活化率的影响132
• 8.2.4.5 环氧基偶联密度的确定132-133
• 8.3 结论133-134
• 第九章 亲和层析介质的制备及鱼类GABAA受体纯化分离初探134-153
• 9.1 实验部分134-144
• 9.1.1 实验试剂134-135
• 9.1.2 实验仪器与设备135
• 9.1.3 缓冲液的配制135-136
• 9.1.4 实验动物136
• 9.1.5 实验方法136-144
• 9.1.5.1 1,4-苯二氮卓类化合物Ro7亲和层析介质的制备136-137
• 9.1.5.2 氟虫腈亲和层析介质的制备137-140
• 9.1.5.2.1 氟虫腈亲和配体的合成137-140
• 9.1.5.3 鱼类GABAA受体的亲和分离140-144
• 9.2 结果与讨论144-152
• 9.2.1 氟虫腈亲和配基的制备及最优反应条件的筛选144
• 9.2.2 不同反应因素对环氧活化琼脂糖凝胶氨化率的影响144-145
• 9.2.3 不同反应因素对氟虫腈亲和配基的偶联率的影响145
• 9.2.4 RO7及氟虫腈亲和配基偶联密度的测定145-146
• 9.2.5 不同去污剂对GABAA受体蛋白溶出量分析146-147
• 9.2.6 苯二氮卓RO7亲和层析及离子交换层析分离纯化鲢鳙脑内GABAA受体147-150
• 9.2.6.1 分离受体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳149
• 9.2.6.2 蛋白回收率的计算149-150
• 9.2.7 氟虫腈亲和层析及离子交换层析分离纯化鲢鳙脑内GABAA受体150-152
• 9.2.7.1 分离受体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳151-152
• 9.2.7.2 蛋白回收率的计算152
• 9.3 结论152-153
• 第十章 结论与展望153-156
• 10.1 本论文的主要创新点153
• 10.2 本论文取得的主要研究结论153-155
• 10.3 下一步工作计划155-156
• 参考文献156-180
• 致谢180-181
• 附录181-187
• F-1 合成中间体及目标产物的1H NMR谱图181-184
• F-2 攻读博士期间发表的论文及申请专利184-185
• F-3 攻读博士期间参与的科研项目185-186
• F-4 攻读博士期间获得的奖励186-187

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本文编号：883195