产气荚膜梭菌B型C58-1株α、β1和ε毒素的高效表达与免疫效力评价及生产工艺改进

发布时间：2017-09-20 00:15

  本文关键词：产气荚膜梭菌B型C58-1株α、β1和ε毒素的高效表达与免疫效力评价及生产工艺改进

  更多相关文章： 产气荚膜梭菌B型 α毒素基因 β1毒素基因 ε毒素基因 高效表达

【摘要】：产气荚膜梭菌,又名魏氏梭菌,能引起人类气性坏疽和多种动物的坏死性肠炎及肠毒血症,是近年来导致我国家畜“猝死症”的主要病原。利用梭菌培养过程中产生的毒素可实现梭菌性疾病的有效免疫,因此,培养此类细菌,获得高浓度、强毒力的毒素,可制备免疫效果优良的疫苗。羊三联四防灭活疫苗(羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症)就是其中之一,在我国被广泛使用。目前专业疫苗公司在培养产气荚膜梭菌生产中大多使用厌气肉肝胃酶消化汤作为培养基,该培养基需要牛肉、肝、胃蛋白酶等原材料,产业化生产成本非常高。另一方面,受到上述原材料品质的影响(如肉品的新鲜度、抗生素的残留等),培养基质量不易掌控,进而影响到成品疫苗质量的稳定性。其次,常规苗需大剂量免疫(5 m L/只),且免疫副反应较重。本研究克隆表达产气荚膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε四种毒素蛋白,并通过小鼠和家兔的免疫保护试验验证这四种毒素蛋白作为亚单位疫苗的可能性;同时,优化了具有良好免疫保护力蛋白的高效表达条件,实现其工程化制备。我们克隆了产气荚膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段,分别构建了表达载体p ETα765、p ETβ1927、p ETε984和p ET1947,并在大肠杆菌BL21获得高效表达。通过Western blotting检测证明表达的四种毒素蛋白均能够与特异的抗体反应,具有良好的反应原性。同时对克隆的C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段序列进行了分析。α毒素序列与目前所有的A-E型产气荚膜梭菌同源性在61%-100%之间。其中,C58-1株α毒素蛋白序列与C型同源性最低(61%),与B-E型同源性为98%-100%,α毒素在产气荚膜梭菌B-E型中具有相同或相似的功能。β1毒素蛋白序列与所有的B型和C型产气荚膜梭菌具有较高的同源性,其同源性在99.4%-100%之间。ε毒素蛋白序列与所有的B型和D型产气荚膜梭菌具有较高的同源性,其同源性在99.7%-100%之间,产气荚膜梭菌的B型和D型的ε毒素蛋白具有相同或相似的生物学功能,包括免疫学特性。在α、β1、ε和β1-ε四种毒素蛋白对动物免疫保护研究实验中,α和β1毒素蛋白无法完全保护注射致死剂量毒素的小鼠,ε和β1-ε毒素蛋白对产气荚膜梭菌B型和D型提供的免疫保护优于全菌疫苗,其中β1-ε毒素蛋白对产气荚膜梭菌B型、C型、D型均具有保护力。根据中华人民共和国兽药典兽医生物制品制造与检验规程,借鉴羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制造及检验规程,采用血清中和法对β1-ε类毒素疫苗进行效力检验,结果证实完全符合国家标准。基于乙酸合成与蛋白诱导表达机制,降低乙酸积累量能够显著提高大肠杆菌表达β1-ε毒素蛋白的水平。考察了p H值、溶氧水平对β1-ε毒素蛋白表达的影响,结果表明,p H值控制在6.5(0-6 h)、7.0(6-16 h)及溶氧水平控制在60%(0-6 h)、30%(6-16 h)时,可显著降低乙酸的积累量,提高菌体生物量及β1-ε毒素蛋白表达量。另外,考察了间歇补料、溶氧反馈补料、p H值反馈补料及恒葡萄糖浓度补料对β1-ε毒素蛋白表达的影响,结果表明在采用分阶段p H值及溶氧控制策略且结合溶氧反馈控制补料时,菌体浓度(OD600为2.045)及β1-ε毒素蛋白表达量(63.24 mg/L)最高,乙酸积累量降低至0.872 g/L。通过对发酵参数筛选及发酵过程控制,降低了乙酸积累量,为实现β1-ε毒素蛋白的工程化制备奠定了基础。
【关键词】：产气荚膜梭菌B型 α毒素基因 β1毒素基因 ε毒素基因 高效表达
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词表11-12
• 第一篇 文献综述12-34
• 1 产气荚膜梭菌研究进展12-18
• 1.1 病原学12
• 1.2 生物学特性12-13
• 1.3 B型产气荚膜梭菌主要毒素的研究进展13-18
• 2 产气荚膜梭菌病流行情况研究进展18-24
• 2.1 影响产气荚膜梭菌病流行的因素18-23
• 2.2 产气荚膜梭菌病的流行情况23-24
• 3 产气荚膜梭菌病防治研究进展24-34
• 3.1 微生态制剂24-25
• 3.2 益生素25-27
• 3.3 植物提取物和香精油27
• 3.4 有机酸27-28
• 3.5 噬菌体、溶菌酶和抗菌肽28-29
• 3.6 疫苗29-32
• 3.7 本项目研究的目的和意义32-34
• 第二篇 研究内容34-100
• 第1章 产气荚膜梭菌B型 α 毒素基因序列分析与克隆表达34-52
• 1.1 材料与方法35-40
• 1.2 结果40-49
• 1.3 讨论49-50
• 1.4 小结50-52
• 第2章 产气荚膜梭菌B型 β1 毒素基因序列分析与克隆表达52-64
• 2.1 材料与方法52-55
• 2.2 结果55-62
• 2.3 讨论62-63
• 2.4 小结63-64
• 第3章 产气荚膜梭菌B型 ε 毒素基因序列分析与克隆表达64-72
• 3.1 材料与方法64-67
• 3.2 结果67-71
• 3.3 讨论71
• 3.4 小结71-72
• 第4章 产气荚膜梭菌B型 β1-ε 毒素基因表达72-78
• 4.1 材料与方法72-74
• 4.2 结果74-77
• 4.3 讨论77
• 4.4 小结77-78
• 第5章 α、β1、ε、β1-ε 四种类毒素疫苗对动物免疫保护研究78-88
• 5.1 材料和方法79-82
• 5.2 结果82-85
• 5.3 讨论85-86
• 5.4 小结86-88
• 第6章 C58-1 株 β1-ε 蛋白高效表达培养条件的优化88-100
• 6.1 实验材料90-92
• 6.2 实验方法92-94
• 6.3 结果与讨论94-99
• 6.4 小结99-100
• 结论100-102
• 创新点102-104
• 参考文献104-120
• 导师简介120-123
• 作者简介123-124
• 致谢124

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孔庆娟;;产气荚膜梭菌α毒素的研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年01期

2 李璐;赵宝华;;产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展[J];畜牧与饲料科学;2011年04期

3 于立新;苏佳;赵晓慧;马学恩;么宏强;;A型产气荚膜梭菌α毒素的基因扩增和提纯鉴定[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2011年04期

4 赵宇亮;张聪敏;王琳;霍萍萍;赵宝华;;产气荚膜梭菌α毒素的研究进展[J];安徽农业科学;2013年12期

5 陈兴祥,薛家宾,黄克和,王启明,徐为中;A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯试验[J];畜牧与兽医;2002年03期

6 李永明,王开功,文明,周碧君;产气荚膜梭菌α-毒素的提取与鉴定[J];中国兽医科技;2002年02期

7 文其乙,刘秀梵;多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌[J];中国预防兽医学报;2002年01期

8 文明,王开功;几种分离产气荚膜梭菌培养基的比较[J];中国兽医杂志;2002年12期

9 梁源祥,李会创,冼恩广,李布勇;牛产气荚膜梭菌的分离与鉴定[J];中国兽医科技;2004年05期

10 赵志军,许崇波,曾瑾,王玉炯;A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达[J];生物技术;2004年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王海荣;吕长辉;赵凯;柴同杰;陆承平;;山东省兔腹泻病例产气荚膜梭菌的分离及基因定型[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

2 么宏强;苏佳;于立新;马学恩;;A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯鉴定及其基因的克隆[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年

3 田冬青;蒋玉文;陈小云;杨京岚;丁家波;;产气荚膜梭菌多重PCR定型方法的建立[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集（下册）[C];2006年

4 李娜;吴建勇;李建军;杨学云;王登峰;段新华;王治才;;D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达[A];生态环境与畜牧业可持续发展学术研讨会暨中国畜牧兽医学会2012年学术年会和第七届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会会议论文集——T07家畜微生态与健康养殖专题[C];2012年

5 许崇利;欧阳红生;许崇波;张艳平;;乳糖诱导剂对重组C型产气荚膜梭菌α毒素基因表达的影响[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

6 王光华;周继章;蔺国珍;郑福英;曹小安;韩文祥;杨良存;宋竹青;邱昌庆;;产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与核苷酸序列分析[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年

7 梁光军;赵李祥;杨旭芹;贾红;张小荣;文其乙;刘秀梵;;应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年

8 许崇波;陈向东;许崇利;逄越;高凤山;;C型产气荚膜梭菌α、β1、β2基因融合[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年

9 裴鸣;张和平;唐昌茂;史宁花;孔芳玲;于维东;白慧勤;马远征;;家畜产气荚膜梭菌病的病理形态学观察[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集[C];2001年

10 李洁萍;倪学勤;曾东;刘丽达;魏豪;;体外筛选拮抗产气荚膜梭菌的鸡源乳酸杆菌[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集（上册）[C];2010年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 林初文;产气荚膜梭菌B型C58-1株α、β1和ε毒素的高效表达与免疫效力评价及生产工艺改进[D];吉林大学;2015年

2 王光华;产气荚膜梭菌的分子诊断与免疫研究[D];中国农业科学院;2010年

3 蔡玉梅;山东省四大湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌毒素型调查及致病机理研究[D];山东农业大学;2008年

4 宋佰芬;产气荚膜梭菌α毒素基因在干酪乳杆菌基因组中的表达及免疫效果评价[D];东北农业大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 乔艺然;A型产气荚膜梭菌感染雏鸡病理形态学研究[D];东北农业大学;2015年

2 吴洁;A型产气荚膜梭菌家兔感染模型的建立[D];山东农业大学;2015年

3 刘雪慧;C、D型产气荚膜梭菌二价类毒素疫苗及抗毒素血清的研制[D];山东农业大学;2015年

4 聂思静;产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用[D];东北农业大学;2015年

5 梁光军;应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定[D];扬州大学;2004年

6 刘家森;兔产气荚膜梭菌（A型）α毒素原核表达产物免疫原性分析[D];东北农业大学;2004年

7 王超;产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价[D];东北农业大学;2012年

8 田冬青;产气荚膜梭菌的多重PCR定型及α、β和ε毒素基因的克隆、表达和抗血清的制备[D];中国兽医药品监察所;2007年

9 邱慧玲;麋鹿产气荚膜梭菌病的流行病学调查[D];南京农业大学;2012年

10 李娜;羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定与α毒素的原核表达和免疫原性研究[D];石河子大学;2013年

，

本文编号：884760