寄生疫霉菌与寄主植物特异性互作的初步研究

发布时间：2017-09-20 08:27

  本文关键词：寄生疫霉菌与寄主植物特异性互作的初步研究

  更多相关文章： 寄生疫霉菌 拟南芥 寄主特异性 遗传分析 本氏烟 细胞坏死 二硫异构酶 吸器 毒性因子

【摘要】：卵菌是一类形态上与真菌相似,但在进化关系上与硅藻和褐藻极为相近的真核微生物。卵菌中包含很多来自植物、动物的病原微生物,其中疫霉属中一些成员是对植物具有毁灭性的病原菌。由于卵菌独特的生理生化特性,绝大部分有效的杀菌剂防治卵菌病害效果极差。近年来,卵菌病原菌在遗传、进化以及与寄主植物互作等方面取得了飞速的进展,极大地推动了对病原菌致病机制和毒性遗传变异规律的认识。然而,对卵菌疫霉属的认识主要集中于少数一些物种,尤其是寄主范围较窄的致病疫霉菌和大豆疫霉菌。相比较而言,寄生疫霉菌是典型的土传病害病原菌,寄主范围广泛,在疫霉属中具有代表性。对寄生疫霉菌与寄主植物互作的分子生物学基础的研究,有助于全面认识卵菌致病的遗传学和分子生物学机制,对卵菌病害的防治策略有十分重要的意义。在本研究中,我们旨在以寄生疫霉菌作为模式探索卵菌的致病机制。一方面,我们以实验室前期建立的寄生疫霉菌侵染模式植物拟南芥的亲和互作系统为基础,通过对表型变异的描述明确寄生疫霉菌与拟南芥存在特异性互作,进一步完善该亲和互作系统。另一方面,我们尝试借助农杆菌介导的基因瞬时表达系统进行高通量筛选寄生疫霉菌侵染烟草叶片的c DNA文库,得到与寄生疫霉菌侵染相关的致病因子。文库筛选中,我们鉴定到一个来自寄生疫霉菌的二硫异构酶基因Pp PDI1,并通过分析该基因的坏死诱导功能,表达特征、基因沉默以及过表达转化子,旨在揭示Pp PDI1在病原菌生长发育以及侵染过程中的作用。主要研究结果如下:1.系统研究了寄生疫霉菌和拟南芥互作的表型变异,主要包括病原菌侵染定殖程度和产孢情况以及寄主植物的抗性反应。根部和叶部接菌测试表明,寄生疫霉菌菌株与寄主植物拟南芥生态型之间存在特异性互作。其中,拟南芥生态型Zurich(Zu-1)对寄生疫霉菌Pp016表现免疫,并且对于测试的20个多样性的寄生疫霉菌菌株具有广谱抗病性。进一步的细胞学观察表明,病原菌最初侵染的植物表皮细胞发生快速和剧烈的过敏性细胞坏死反应,从而抑制了病原菌的侵染。2.遗传分析表明拟南芥Zu-1对寄生疫霉菌的抗性由半显性单基因位点控制。将抗病生态型Zu-1与感病生态型Landsberg(Ler)进行遗传杂交,对其后代进行接菌分析,我们发现F1植株叶片发黄,病斑扩展受到限制,表现中间型的表型;F2群体出现了分离,且分离比(N:Y:H)接近1:2:1(χ2=0.307,P=0.8578)。遗传分析数据表明拟南芥Zu-1的抗病性可能是由半显性的单基因位点控制,我们将这个位点定义为RPPA1Zu-1(for Resistance to Phytophthora parasitica 1),并通过Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing(SLAF-seq)测序分析,将该位点初步定位于拟南芥IV染色体7.1-11.2Mb区域。3.功能筛选鉴定参与植物-寄生疫霉菌互作的关键基因。通过构建寄生疫霉菌侵染烟草叶片的高质量的c DNA文库,以植物细胞坏死为表型,利用农杆菌介导的基因瞬时表达系统在普通烟草和本氏烟叶片上对文库进行高通量的筛选,从筛选的16,000个c DNA克隆中,获得24个具有诱导坏死反应活性的候选蛋白。在筛选得到的候选蛋白中,我们对一个来自寄生疫霉菌的二硫异构酶蛋白(Pp PDI1)进行了进一步的分析,确认了其在本氏烟的叶片上引发强烈的坏死反应。Pp PDI1包含TRX-like结构域,在真核生物中非常保守。缺失突变体分析表明,Pp PDI第一个TRX-like结构域的催化位点CGHC对诱导植物细胞坏死活性至关重要。4.初步确认Pp PDI1作为一个毒性因子,在寄生疫霉菌侵染寄主植物过程中发挥作用。Pp PDI1基因在寄生疫霉菌的所有阶段都有表达,但相对于萌发休止孢阶段和侵染早期(36hpi),在侵染后期(60hpi)上调表达。为了进一步探索Pp PDI1在寄生疫霉菌侵染过程中的作用,我们利用遗传转化,分别得到基因沉默和过表达的转化子。对基因沉默的转化子进行分析,发现Pp PDI1的沉默效率非常低,并且该基因的表达水平随后恢复,表明Pp PDI1的表达受到一定的选择性,可能是病原菌生长发育所必需的。对过表达Pp PDI1与EGFP融合的转化子进行分析,发现在侵染过程中,Pp PDI1在吸器处高度累积。与对照1121相比较,过表达Pp PDI1-EGFP转化子产生的吸器数量明显增加。此外,实时定量PCR结果显示,过表达的转化子在侵染过程中生物定殖量增多。综上,我们推测Pp PDI1有可能作为一个毒性因子在寄生疫霉菌侵染寄主植物过程中发挥作用。
【关键词】：寄生疫霉菌 拟南芥 寄主特异性 遗传分析 本氏烟 细胞坏死 二硫异构酶 吸器 毒性因子
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文献综述13-36
• 1.1 卵菌与寄主植物互作研究14-25
• 1.1.1 病原菌与植物互作的分子基础14-17
• 1.1.2 卵菌与寄主植物互作进展17-23
• 1.1.3 卵菌-拟南芥模式系统23-25
• 1.2 寄生疫霉菌模式系统25-30
• 1.2.1 寄生疫霉菌的系统发育25
• 1.2.2 寄生疫霉菌的生活史25-26
• 1.2.3 寄生疫霉菌的分子遗传操作26-28
• 1.2.4 寄生疫霉菌的基因组学28
• 1.2.5 寄生疫霉菌与拟南芥互作模式系统28-29
• 1.2.6 寄生疫霉菌致病机制的分子基础29-30
• 1.3 农杆菌介导的基因瞬时表达体系在卵菌基因功能分析中的应用30-31
• 1.4 蛋白质二硫异构酶31-34
• 1.4.1 蛋白质二硫异构酶的家族成员及其结构31-33
• 1.4.2 蛋白质二硫异构酶的定位33
• 1.4.3 蛋白质二硫异构酶在病原菌侵染中的作用33-34
• 1.5 本研究的目的和意义34-36
• 第二章 拟南芥对寄生疫霉菌的抗性表型变异和遗传分析36-55
• 2.1 试验材料36-37
• 2.1.1 菌株36-37
• 2.1.2 植物材料37
• 2.1.3 试剂,仪器37
• 2.2 试验方法37-40
• 2.2.1 植物的种植37
• 2.2.2 寄生疫霉菌的培养37-38
• 2.2.3 接菌方法38
• 2.2.4 细胞学观察38-39
• 2.2.5 胼胝质染色39
• 2.2.6 拟南芥的遗传杂交39
• 2.2.7 SLAF-seq分析RPPAI~(Zu-1)位点39-40
• 2.3 结果与分析40-52
• 2.3.1 寄生疫霉菌与烟草特异性互作40-41
• 2.3.2 寄生疫霉菌与拟南芥特异性互作41-46
• 2.3.3 拟南芥生态型Zu-1对寄生疫霉菌Pp016表现极抗46
• 2.3.4 Zu-1对寄生疫霉菌具有普遍抗病性46-48
• 2.3.5 细胞学观察Zu-1对寄生疫霉菌的抗病性48-49
• 2.3.6 寄生疫霉菌能够侵染Zu-1根部49-50
• 2.3.7 Zu-1对于寄生疫霉菌抗性的遗传分析50-52
• 2.3.8 SLAF-seq初步定位RPPAI~(Zu-1)位点52
• 2.4 讨论52-55
• 第三章 寄生疫霉菌坏死诱导蛋白PpPDI1在侵染中的作用55-86
• 3.1 试验材料56
• 3.1.1 菌株,质粒56
• 3.1.2 植物材料56
• 3.1.3 试剂,仪器56
• 3.2 试验方法56-65
• 3.2.1 寄生疫霉菌侵染烟草cDNA文库的构建56-58
• 3.2.2 农杆菌介导的基因瞬时表达试验58-60
• 3.2.3 文库的规模筛选60
• 3.2.4 寄生疫霉菌的遗传转化以及转化子的筛选60-62
• 3.2.5 实时定量RT-PCR检测PpPDI1基因的表达62-64
• 3.2.6 实时定量PCR检测寄生疫霉菌生物量64-65
• 3.2.7 细胞学观察65
• 3.3 结果与分析65-83
• 3.3.1 寄生疫霉菌侵染烟草cDNA文库的构建65-66
• 3.3.2 农杆菌瞬时表达条件的优化66-67
• 3.3.3 高通量筛选cDNA文库鉴定坏死诱导蛋白67-70
• 3.3.4 PpPDI1在本氏烟上引发强烈的细胞坏死反应70-71
• 3.3.5 PpPDI1在真核生物中具有保守性71-75
• 3.3.6 PpPDI1基因表达模式分析75-76
• 3.3.7 瞬时表达确定PpPDI1诱导坏死的功能区段76-78
• 3.3.8 基因沉默表明PpPDI1对于寄生疫霉菌是必需的78-80
• 3.3.9 过表达PpPDI1-EGFP转化子产生吸器类似结构80-81
• 3.3.10 寄生疫霉菌侵染本氏烟过程中PpPDI1特异性在吸器累积81-83
• 3.4 讨论83-86
• 第四章 结论与展望86-88
• 4.1 结论86
• 4.2 创新点86-87
• 4.3 研究展望87-88
• 参考文献88-103
• 致谢103-104
• 作者简介104

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王志强;周智敏;郭占云;;蛋白质二硫键异构酶家族的结构与功能[J];生命科学研究;2009年06期

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本文编号：886993