水稻JAZ家族抗逆相关基因的鉴定和功能分析

发布时间：2017-09-24 21:13

  本文关键词：水稻JAZ家族抗逆相关基因的鉴定和功能分析

  更多相关文章： 茉莉酸 干旱 盐胁迫 离子通道 JAZ bHLH

【摘要】：植物感受干旱、高盐等逆境,激发内源信号传递系统,调节非生物胁迫应答和适应相关基因表达,进而适应不利环境。水稻对非生物逆境胁迫的响应涉及到生理和分子水平的调控过程。寻找抗逆相关的调控基因对阐明水稻对非生物逆境胁迫的响应机制以及指导水稻抗逆性遗传改良具有重要意义。JAZ是茉莉酸信号响应途径中的负调控因子。水稻中大部分JAZ家族的基因都受到非生物逆境胁迫的诱导表达。我们对6个在逆境胁迫芯片数据中受到诱导表达的JAZ基因转化水稻品种中花11(Oryza sativa L. ssp japonica)。对超量表达转基因材料进行进行了苗期逆境胁迫表型筛选。其中两个基因(OsJAZl和OsJAZ9)的转基因材料分别对干旱和盐胁迫表现出较为明显的表型。本研究对这两个参与到JA信号传递和非生物逆境胁迫应答的JAZ基因做了更加深入的功能分析,主要结果如下：1. OsJAZ1受到逆境胁迫诱导表达。OsJAZ1的超量表达植株相比对照旱敏感,而对ABA处理相比对照不敏感；而OsJAZ1功能缺失突变体植株相比对照抗旱,却对ABA处理相比对照敏感。OsJAZ1功能缺失突变体材料中干旱胁迫后上调表达的基因数目比与OsJAZ1的超量表达植株和野生型的干旱诱导上调的基因数目明显要多。OsJAZ1在酵母中与OsMYC2互作,它和OsCOI1a的互作依赖于冠菌素。OsJAZ1超量表达和OsJAZ1功能缺失突变体的表型可能和ABA响应的基因有关,筛选酵母双杂交文库获得一个OsJAZ1的互作蛋白bZIP类型转录因子OsBZ8,双分子荧光互补实验和酵母双杂交点对点实验验证了OsJAZ1能和它互作。OsJAZ1和OsBZ8的全长在酵母中都没有转录激活活性。OsBZ8的表达量受到逆境诱导表达,其启动子上有多个逆境相关的顺式作用元件。荧光素酶实验结果说明OsJAZ1具有转录抑制子的功能. OsBZ8能够结合到多个ABA相关基因的启动子的ABRE顺式作用元件上。OsJAZ1l能抑制OsBZ8的转录激活活性。此外,OsJAZ1也可以与OsNINJA互作,它们可能和OsBZ8组成的蛋白复合体调控下游基因的表达,继而调控水稻对干旱胁迫的应答。2. OsJAZ9抑制表达转基因水稻的表型是相比对照对盐胁迫敏感。OsJAZ9超量表达和OsJAZ9抑制表达材料盐胁迫之后地上部分的Na+/K+也显著不同。OsJAZ9抑制表达材料对JA敏感表型以及酵母双杂交和pull-down实验结果都验证了OsJAZ9和OsCOIla的互作,这也说明OsJAZ9在JA信号传递中起着作用。OsAKTl, OsHAK10, OsHAK21和OsHAK27的表达模式在OsJAZ9的超量表达和抑制表达植株之中不同。受到JA处理调控的三个离子通道转运蛋白OsSKCl,OsHAK21和OsHAK27在OsJAZ9超量表达材料中对JA处理的表达模式和野生型以及OsJAZ9抑制表达材料相反。通过酵母双杂交文库筛选筛选到了OsJAZ9的互作蛋白OsNINJA和OsbHLH062。双分子荧光以及酵母双杂交的实验结果都说明了OsJAZ9可以和水稻bHLH转录因子OsbHLH062和OsNINJA互作. OsNINJA能和水稻中大部分JAZ蛋白互作。OsNINJA和OsJAZ9的TIFY结构域互作,而OsbHLH062和OsJAZ9的Jas结构域互作,OsNINJA和OsbHLH062与OsJAZ9的互作位点没有重合部分。OsbHLH062只能和水稻中的OsJAZ8, OsJAZ9和OsJAZ11这三个JAZ蛋白互作。酵母单杂交和凝胶电泳迁移的实验结果说明OsbHLH062能够特异结合到同时受OsJAZ9和JA调控的离子通道蛋白基因启动子的顺式作用元件 E-box上。用水稻原生质体瞬时表达系统对OsbHLH062, OsNINJA和OsJAZ9的转录活性进行了分析,结果表明OsbHLH062能够激活下游基因的转录,而OsNINJA和OsJAZ9自身是转录抑制子,也能抑制OsbHLH062介导的转录激活。这些结果表明OsNINJA-OsJAZ9-OsbHLH062以转录复合体形式调控JA响应相关下游基因的表达,继而影响水稻对外界胁迫的响应。前人报道中JAZ蛋白的互作蛋白很多,但关于互作蛋白和复合体在非生物逆境中应答起到的作用却很少报道。本研究着重研究了水稻中两个不同的JAZ蛋白及其互作的转录激活类型的转录因子和转录抑制子OsNINJA的相互作用对非生物逆境应答的影响,其中OsJAZ1的互作蛋白OsBZ8结合到ABRE顺式作用元件上调控ABA响应基因的转录；OsJAZ9的互作蛋白OsbHLH062结合到离子转运通道蛋白基因的启动子的E-box顺式作用元件上调控其转录。这些结果加深了对JAZ蛋白参与抗逆应答调控的分子机制的认识。
【关键词】：茉莉酸 干旱 盐胁迫 离子通道 JAZ bHLH
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 缩写名词表14-15
• 1 前言15-45
• 1.1 研究问题由来15
• 1.2 文献综述15-44
• 1.2.1 植物对逆境胁迫的响应15-24
• 1.2.1.1 参与逆境胁迫应答的转录因子和功能蛋白17
• 1.2.1.1.1 参与逆境胁迫应答的转录因子17
• 1.2.1.1.2 参与逆境胁迫应答的功能蛋白17
• 1.2.1.2 活性氧相关基因17-18
• 1.2.1.3 代谢产物和代谢组学相关18-19
• 1.2.1.3.1 糖和糖醇18-19
• 1.2.1.3.2 胺和氨基酸19
• 1.2.1.4 植物对干旱胁迫的响应19-21
• 1.2.1.4.1 依赖ABA的干旱信号传导20-21
• 1.2.1.4.2 不依赖ABA的干早信号传导21
• 1.2.1.5 植物对盐胁迫的响应21-23
• 1.2.1.6 植物对低温胁迫的响应23-24
• 1.2.2 茉莉酸(JA)和相关基因研究进展24-32
• 1.2.2.1 JA的合成24-26
• 1.2.2.2 茉莉酸与非生物逆境胁迫26-28
• 1.2.2.3 调控蛋白在JA介导的非生物逆境信号传递中的作用28-31
• 1.2.2.3.1 茉莉酸信号传递与JAZ28-31
• 1.2.2.4 JA信号传递中的转录因子31-32
• 1.2.3 离子通道蛋白在植物非生物逆境胁迫响应中的作用32-33
• 1.2.4 植物功能基因组学的分析方法33-40
• 1.2.4.1 正向遗传学34
• 1.2.4.1.1 图位克隆34
• 1.2.4.1.2 全基因组关联分析GWAS34
• 1.2.4.2 反向遗传学34-40
• 1.2.4.2.1 基因功能丧失或减弱34-37
• 1.2.4.2.1.1 RNA沉默34-36
• 1.2.4.2.1.2 T-DNA插入36
• 1.2.4.2.1.3 CRISPR/Cas936-37
• 1.2.4.2.2 基因功能增加或获得37-40
• 1.2.4.2.2.1 组成型超量表达37-38
• 1.2.4.2.2.2 诱导型超量表达38-39
• 1.2.4.2.2.3 激活标签突变体39-40
• 1.2.5 顺式作用元件及其对基因转录的调控40-42
• 1.2.5.1 转录组水平上了解基因功能41-42
• 1.2.5.1.1 芯片技术41
• 1.2.5.1.2 转录组测序(RNA-seq)41-42
• 1.2.6 研究生物大分子互作的策略42-44
• 1.2.6.1 酵母单杂交和酵母双杂交42
• 1.2.6.2 双分子荧光互补42-43
• 1.2.6.3 EMSA43
• 1.2.6.4 染色质免疫沉淀(ChIP)43-44
• 1.2.6.5 双荧光素酶检测互作44
• 1.3 本研究的目的和意义44-45
• 2 材料与方法45-59
• 2.1 水稻材料和来源45
• 2.2 菌株和载体45-47
• 2.3 候选基因的选择、序列分析和农杆菌介导的遗传转化47-48
• 2.4 表达量检测48-49
• 2.4.1 RNA抽提和反转录48
• 2.4.2 Northern杂交48
• 2.4.3 实时定量(Real-time quantitative)PCR48-49
• 2.5 水稻DNA抽提,突变体的基因型检测和转基因植株阳性检测49-50
• 2.5.1 水稻DNA的抽提49
• 2.5.2 突变体的基因型检测49
• 2.5.3 转基因植株阳性检测49-50
• 2.6 用于芯片分析的水稻材料准备50
• 2.7 非生物逆境胁迫表型鉴定50-51
• 2.7.1 培养基条件下非生物逆境表型的鉴定50-51
• 2.7.2 苗期干旱表型的鉴定51
• 2.7.3 苗期耐盐表型的鉴定51
• 2.8 离体叶片失水速率测定51-52
• 2.9 载体的构建52-53
• 2.10 水稻离子含量测定53
• 2.11 亚细胞定位53-54
• 2.12 双分子荧光互补54
• 2.13 酵母中的实验54-56
• 2.13.1 自激活检测54-55
• 2.13.2 酵母双杂交文库筛选55
• 2.13.3 酵母双杂交点对点检测55-56
• 2.13.4 酵母单杂交56
• 2.14 原核表达56-57
• 2.15 凝胶电泳迁移实验(EMSA)57
• 2.16 荧光素酶实验57-59
• 3 结果与分析59-115
• 3.1 候选基因的遗传转化和抗逆性筛选59-66
• 3.1.1 转化载体的构建和遗传转化59-60
• 3.1.2 转基因材料的表达量检测60-62
• 3.1.3 转基因材料阳性检测62-63
• 3.1.4 候选基因突变体插入位点检测和突变体材料表达量检测63-65
• 3.1.5 转基因材料的初步表型筛选65-66
• 3.2 OsJAZ1的基因功能鉴定66-89
• 3.2.1 OsJAZ1的序列分析66-67
• 3.2.2 OsJAZ1的表达模式分析67-68
• 3.2.3 OsJAZ1的亚细胞定位68-69
• 3.2.4 OsJAZ1超量表达和突变体植株表型分析69-75
• 3.2.4.1 OsJAZ1超量表达植株对干旱敏感69-70
• 3.2.4.2 OsJAZ1超量表达植株对ABA敏感性降低70-72
• 3.2.4.3 osjaz1-1抗旱性增强72-74
• 3.2.4.4 osjaz1-1苗期对ABA敏感性增强74-75
• 3.2.5 OsJAZ1超表达植株和突变体旱胁迫全基因组芯片分析75-77
• 3.2.6 OsJAZ1的转录激活活性和其与OsMYC2,OsCOI1a的互作77-79
• 3.2.7 OsJAZ1互作蛋白筛选和分析79-80
• 3.2.8 OsJAZ1互作蛋白OsBZ8的初步分析80-89
• 3.2.8.1 OsBZ8与OsJAZ1互作验证80-82
• 3.2.8.2 OsBZ8序列和表达谱分析82-85
• 3.2.8.3 OsBZ8自激活活性分析85
• 3.2.8.4 OsBZ8候选靶基因的确定85-87
• 3.2.8.5 OsBZ8,OsNINJA与OsJAZ1的相互作用87-89
• 3.3 OsJAZ9功能鉴定89-115
• 3.3.1 OsJAZ9转基因材料植株对盐胁迫的生理数据分析89-91
• 3.3.2 OsJAZ9在JA信号传导中发挥作用91-95
• 3.3.3 转基因材料离子通道基因表达量分析95-96
• 3.3.4 离子通道转运基因受到JA的调控96-99
• 3.3.5 OsJAZ9互作基因筛选99-101
• 3.3.6 互作蛋白OsNINJA功能分析101-106
• 3.3.6.1 OsNINJA序列分析和互作分析101-104
• 3.3.6.2 OsNINJA的转录活性分析104-105
• 3.3.6.3 OsNINJA和OSJAZ9的双分子荧光标记互作验证105-106
• 3.3.6.4 OsNINJA和OsJAZs的互作验证106
• 3.3.7 互作蛋白OsbHLH062功能分析106-112
• 3.3.7.1 OsbHLH062和OsJAZ9的互作位点检测和BiFC验证体内互作106-108
• 3.3.7.2 OsbHLH062和OsJAZ9的转录活性分析108-109
• 3.3.7.3 OsbHLH062对顺式作用元件E-box的结合分析109-112
• 3.3.7.3.1 酵母单杂交分析OsbHLH062对顺式作用元件E-box的结合109-110
• 3.3.7.3.2 凝胶电泳迁移实验分析OsbHLH062对顺式作用元件E-box的结合能力110-111
• 3.3.7.3.3 OsbHLH062对顺式作用元件E-box在水稻体内的结合能力111-112
• 3.3.8 OsJAZ9和OsNINJA对OsbHLH062的转录抑制作用112-113
• 3.3.9 OsbHLH062与OsJAZs的互作113-115
• 4 讨论115-124
• 4.1 OsJAZ1在非生物逆境应答中的功能探讨115-119
• 4.1.1 OsJAZ1在非生物逆境应答与ABA相关115-116
• 4.1.2 OsJAZ1和其互作蛋白OsBZ8及OsMYC2的关系116-118
• 4.1.3 OsJAZ1存在的问题和进一步实验设想118-119
• 4.2 OsJAZ9在非生物逆境应答中的功能探讨119-122
• 4.2.1 OsJAZ9通过调节Na~+/K~+比参与到盐胁迫响应过程中119-120
• 4.2.2 OsJAZ9作为一个转录调控子参与到非生物逆境胁迫响应中120-121
• 4.2.3 OsbHLH062-JAZ9-OsNINJA：转录调控复合体121-122
• 4.3 OsJAZ1和OsJAZ9的联系和区别122-124
• 参考文献124-138
• 附录A Protocol and Recipe138-159
• 附录B 附表159-192
• 作者简介192-193
• 致谢193

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