日龄、日粮精粗比对陕北白绒山羊瘤胃微生物区系影响的研究

发布时间：2017-10-04 20:29

  本文关键词：日龄、日粮精粗比对陕北白绒山羊瘤胃微生物区系影响的研究

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【摘要】：瘤胃微生物和反刍动物具有互利互惠的共生关系,瘤胃微生物能消化利用不能被反刍动物直接消化的植物纤维,并转化成肉奶等动物产品。优化瘤胃微生物区系可以提高动物的生产性能、维持机体的健康、减少环境的污染以及改善动物产品质量等。另外瘤胃内含有丰富的微生物和功能基因资源。因此,瘤胃微生物区系的研究一直是反刍动物研究的热点领域。乳酸杆菌具有诸多的益生功能,有些乳酸杆菌已经作为益生素添加剂应用到饲料生产和乳制品中,乳酸杆菌对于动物体具有许多生理生化的作用,例如维持动物健康,调节免疫系统功能,降低血压,提高动物的生产性能,增强动物的代谢能力,调节动物消化道微生物区系平衡等。另外,乳酸杆菌也是一种理想的口服疫苗递送载体。因此弄清乳酸杆菌能否在动物胃肠道定植以及其定植的部位具有重要的意义。本研究的目的在于通过高通量测序手段研究不同日龄陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的变化,旨在探究瘤胃微生物区系的建群与自平衡过程;初步研究在不同精粗比日粮条件下瘤胃微生物的菌群变化规律,旨在为陕北白绒山羊生产和营养调控提供理论依据;构建表达绿色荧光蛋白的羊源乳酸杆菌,研究其在陕北白绒山羊胃肠道的定植规律,为建立表达纤维素酶、生物素等活性物质的羊源重组菌奠定理论基础和技术方法。主要研究结果如下:1.80-110日龄陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的研究山羊日龄显著影响陕北白绒山羊瘤胃微生物区系。在门的水平上,80、90和100日龄组瘤胃含量最多的两种菌群为Firmicutes和Synergistete,而110日龄组瘤胃含量最多的两种菌群为Bacteroidetes和Firmicutes。随着年龄的增长,Bacteroidetes和Proteobacteria的含量呈显著增多的趋势(P0.05),而Firmicutes(P0.1)和Synergistetes(P0.05)的含量呈显著减少的趋势。在属的水平上,在80日龄组,BS11_gut_group的含量最多;在90日龄组,Roseburia的含量最多;在100和110日龄组,Prevotella的含量最多。随着年龄的增长,Prevotella,RC9_gut_group和p2534-18B5_gut_group呈显著增多的趋势(P0.05),而Ruminococcus和Selenomonas呈显著减少的趋势(P0.05)。陕北白绒山羊瘤胃内还有大量未鉴定与培养的细菌菌群,随着年龄的增长,其含量呈显著减少的趋势(P0.05)。2.不同精粗比日粮对陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的影响不同精粗比日粮显著影响陕北白绒山羊瘤胃细菌菌群组成。在门的水平上,不同精粗比日粮处理组瘤胃含量最多的两种细菌菌群均为Bacteroidetes和Firmicutes。随着日粮精料比例的增加,Actinobacteria和Proteobacteria的含量呈显著增多的趋势(P0.05),而Bacteroidetes的含量呈显著减少的趋势(P0.05)。在属的水平上,在不同精粗比日粮处理组,Prevotella的含量均最多。随着日粮精料比例的增加,Prevotella,Selenomonas和Treponema的含量呈显著增多的趋势(P0.05),而Oscillospira和Succiniclasticum的含量呈显著减少的趋势(P0.05)。不同日粮处理组纤维分解菌的含量均低于1%,随着日粮精料比例的增加,纤维降解菌Ruminococcus和Butyrivibrio的含量呈显著减少的趋势(P0.05)。不同精粗比日粮显著影响陕北白绒山羊瘤胃真菌菌群组成。在门的水平上,在不同精粗比日粮处理组,Ascomycota的含量均最多。随着日粮精料比例的增加,Ascomycota,Basidiomycota和Zygomycota的含量呈显著增多的趋势(P0.05),而Chytridiomycota的含量呈显著减少的趋势(P0.05)。在属的水平上,在C30日粮处理组,Neocallimastix含量最多,而在C50和C70日粮处理组,Candida的含量最多。随着日粮精料比例的增加,Alternaria,Aspergillus,Neocallimastix,Orpinomyces,Piromyces和Stachybotrys的含量呈显著减少的趋势(P0.05),而Candida,Penicillium和Trichosporon的含量呈显著增多的趋势(P0.05)。3.转gfp基因的羊源乳酸菌及其在山羊胃肠道定植潜力的研究采用MRS筛选培养基从陕北白绒山羊瘤胃分离得到10株乳酸杆菌,通过16Sr DNA保守序列分析对其鉴定,鉴定结果为:6株为植物乳酸杆菌,2株为弯曲乳酸杆菌,1株为干酪乳酸杆菌,1株为未命名乳酸杆菌。利用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为目的基因,构建表达载体p LEM415-gfp-p32,电转化到植物乳酸杆菌中,得到表达荧光蛋白的重组植物乳酸杆菌。陕北白绒山羊口服重组乳酸杆菌后,能在胃肠道的不同部位检测到重组菌,随着口服时间的延长,在瘤胃中重组乳酸杆菌的浓度呈先减少后增加的变化趋势(P0.05),而在十二指肠中重组乳酸杆菌的浓度呈线性减少的变化趋势(P0.05)。综上所述:日龄显著影响陕北白绒山羊的瘤胃微生物区系。不同日龄组陕北白绒山羊瘤胃细菌群落组成不同。随着年龄的增长,主要的瘤胃细菌菌群呈规律性的变化。不同精粗比日粮显著影响陕北白绒山羊的瘤胃微生物区系。不同精粗比日粮处理组陕北白绒山羊瘤胃微生物群落组成不同。随着日粮精料比例的增加,主要的瘤胃微生物菌群呈规律性的变化。获得表达绿色荧光蛋白的羊源重组乳酸杆菌,成功构建了羊源乳酸杆菌表达系统。重组菌在瘤胃内具有定植潜力而在十二指肠不具有定植潜力。
【关键词】：陕北白绒山羊 瘤胃 高通量测序 植物乳酸杆菌 绿色荧光蛋白 定植
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827.5
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-27
• 1.1 瘤胃微生物区系的研究进展13-22
• 1.1.1 瘤胃微生物的主要种类13-14
• 1.1.2 影响瘤胃微生物数量的因素14-16
• 1.1.3 瘤胃微生物多样性的研究方法16-22
• 1.2 乳酸杆菌研究进展22-25
• 1.2.1 乳酸菌定义和分类22-23
• 1.2.2 乳酸杆菌作为.服疫苗递送载体的研究进展23-24
• 1.2.3 乳酸杆菌基因工程菌的研究进展24-25
• 1.3 本研究的目的意义25-27
• 第二章 80-110日龄陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的研究27-42
• 2.1 材料与方法27-30
• 2.1.1 材料27-29
• 2.1.2 方法29-30
• 2.2 结果与分析30-39
• 2.2.1 样本细菌基因组DNA提取30-31
• 2.2.2 16Sr RNA基因V1-V3区域扩增结果31
• 2.2.3 测序基本数据分析31-33
• 2.2.4 细菌群落组成分析33-36
• 2.2.5 不同日龄对陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的影响36-39
• 2.3 讨论39-41
• 2.4 小结41-42
• 第三章 不同精粗比日粮对陕北白绒山羊瘤胃微生物区系的影响42-65
• 3.1 材料与方法42-44
• 3.1.1 材料42-43
• 3.1.2 方法43-44
• 3.2 结果与分析44-62
• 3.2.1 测序基本数据分析44-48
• 3.2.2 微生物群落组成分析48-53
• 3.2.3 不同精粗比日粮对瘤胃微生物区系的影响53-62
• 3.3 讨论62-64
• 3.4 小结64-65
• 第四章 转GFP基因的羊源乳酸菌及其在山羊胃肠道定植潜力的研究65-82
• 4.1 材料与方法65-74
• 4.1.1 材料65-66
• 4.1.2 方法66-74
• 4.2 结果与分析74-79
• 4.2.1 羊源乳酸杆菌的筛选与鉴定74-75
• 4.2.2 重组质粒pLEM415-gfp-p32 PCR鉴定75-76
• 4.2.3 重组质粒pLEM415-gfp-p32酶切鉴定76
• 4.2.4 重组乳酸杆菌质粒PCR鉴定76-77
• 4.2.5 目的基因表达观察77-78
• 4.2.6 目的基因表达稳定性观察78-79
• 4.2.7 羊源重组植物乳杆菌在陕北白绒山羊体内定植分布的研究79
• 4.3 讨论79-81
• 4.4 小结81-82
• 第五章 结论与创新点82-83
• 5.1 结论82
• 5.2 创新点82
• 5.3 还需要深入研究的内容82-83
• 参考文献83-97
• 附录97-106
• 缩略词（ABBREVIATION）106-107
• 致谢107-108
• 作者简介108

【参考文献】

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1 何力;郝勃;谢从新;罗晓松;张征;朱祥云;;草鱼肠道纤维素酶产生菌主要种类的分离与鉴定[J];应用与环境生物学报;2009年03期

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本文编号：972693