葡萄WRKYs响应葡萄根瘤蚜侵害的分子机理

发布时间：2017-10-05 16:13

  本文关键词：葡萄WRKYs响应葡萄根瘤蚜侵害的分子机理

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【摘要】：葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)专性寄生于葡萄根系和叶片,历史上曾对欧洲葡萄造成了毁灭性为害。目前生产上主要通过使用抗性砧木嫁接防治根瘤蚜,但我们对葡萄砧木抗根瘤蚜侵害的分子机理还知之甚少。植物WRKY转录因子是植物界数量最多的转录因子家族之一,本论文以敏感品种克瑞森和抗性砧木1103Paulsen为试材,探究了葡萄WRKYs对根瘤蚜侵害的应答反应,主要研究结果如下。1、葡萄(Vitis vinifera L.)中共发现63个WRKY转录因子基因。根据拟南芥WRKY转录因子的分类原则,除VvWRKY32-2外其它共分成3大类和7个亚类,63个葡萄WRKY基因不均匀地分布在除第3号染色体外的其它18条染色体和一条未知染色体上,亚细胞定位预测软件分析表明绝大多数葡萄WRKY定位于细胞核。外显子及蛋白长度分析表明序列缺失参与WRKY进化,而基因组复制促进了WRKY家族成员扩增。在发育的葡萄果实各组织(果皮、果肉和种子)中,葡萄WRKY基因表现出不同的表达丰度,还有一些基因表达存在明显的时空特异性。2、WRKY基因响应葡萄-根瘤蚜之间的互作反应。根瘤蚜侵染导致敏感品种克瑞森30多个WRKY基因的表达量发生变化,多数基因的表达量上调,仅Vv WRKY20、24、42、49和51-2表达量显著下调。抗性砧木1103 Paulsen(V.Berlandieri×V.Rupetris)WRKY基因表达量变化与克瑞森基本一致,但VvWRKY2-2和VvWRKY42在1103Paulsen中的表达模式与克瑞森相反,这可能是决定不同基因型葡萄对根瘤蚜抗性的关键调节因子。根结形成时部分WRKY基因表现出不同的表达模式,与未侵染的对照相比根结中VvWRKY2和VvWRKY46表达量下调,而Vv WRKY51-1、VvWRKY53和Vv WRKY55表达量升高,表明WRKY基因正/负调节葡萄对根瘤蚜的防御反应。另外,WRKY基因在靠近根结未被侵害的根中也表现出与根结中类似的表达模式,说明根瘤蚜对葡萄WRKY基因的诱导是系统性的。3、我们同时检测了部分WRKY基因在敏感、中抗和免疫葡萄根系和叶片中的表达变化,结果发现葡萄根系和叶片中WRKY基因组成型表达量与其根瘤蚜抗性强弱无相关性,根瘤蚜侵害能够启动葡萄WRKY基因介导的诱导型防御反应。4、葡萄SA信号途径相关基因参与葡萄-根瘤蚜互作反应。根瘤蚜瞬时侵害抑制SA积累相关基因如VvPAD4和VvMATE的表达,使根系和叶片中总SA含量分别下降24%和58%,但同时诱导1103Paulsen根系中PRs基因表达量上调,如VvG1、VvCHI1B、VvCHI1B1和PR3。施用外源SA和Me-JA分别降低根瘤蚜若虫成活率50%和24%。推测PRs基因的上调与总SA的下降无关,是受到其它因子的调控。另外,VvCHI1B在1103P形成的根结中表达量上调了50倍,而在克瑞森的根结中表达量下调。5、拟南芥同源基因功能分析推测VvWRKY40-1和VvWRKY46参与葡萄SA信号途径,且与克瑞森相比这两个基因在1103Paulsen中持续响应根瘤蚜侵害。Race结果表明VvWRKY40-1和VvWRKY46的开放阅读框长度分别是954bp和1050bp,其编码的蛋白都定位于细胞核。瞬时表达和体外试验证明VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白能够与顺式作用元件Wbox(T)(T)TGAC(C/T)结合互作,启动下游基因表达。酵母单杂交和同源共转化试验发现VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白分别与VvCHI1B基因启动子互作,这表明WRKY蛋白能在转录水平直接调节PRs基因的表达参与葡萄对根瘤蚜防御反应。
【关键词】：葡萄 根瘤蚜 侵害 WRKY PRs 防御反应
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.631
【目录】：

• 摘要13-15
• Abstract15-18
• 1 前言18-35
• 1.1 葡萄根瘤蚜的危害18
• 1.2 敏感葡萄对根瘤蚜侵染的响应18-20
• 1.2.1 根瘤蚜侵染对敏感葡萄组织结构的影响18-19
• 1.2.2 敏感葡萄对根瘤蚜侵染的生理生化响应19-20
• 1.2.3 敏感葡萄在根瘤蚜侵染过程中的分子响应20
• 1.3 抗性砧木对根瘤蚜侵害的防御反应20-22
• 1.3.1 抗性砧木组织结构特性20-21
• 1.3.2 抗性砧木的生理及分子响应21-22
• 1.4 植物WRKY转录因子家族基因的发现和分布22-24
• 1.5 WRKY转录因子基因的起源及在植物中的进化24
• 1.6 WRKY转录因子参与植物对生物胁迫的抗性反应24-29
• 1.6.1 植物WRKY对病原微生物的抗性防御反应26-29
• 1.6.2 植物WRKY调节寄主与植物寄生害虫间的互作反应29
• 1.7 WRKY在植物抗病害防御反应中的作用29-34
• 1.7.1 WRKY参与植物抗逆分子信号转导30-32
• 1.7.1.1 WRKY调控植物SA信号途径30-32
• 1.7.1.2 WRKY参与植物MAPK信号级联反应32
• 1.7.2 WRKY调节植物次生代谢物合成32-34
• 1.8 研究的目的和意义34-35
• 2 材料与方法35-59
• 2.1 材料35-41
• 2.1.1 植物材料35
• 2.1.2 葡萄根瘤蚜35
• 2.1.3 菌株35-36
• 2.1.4 载体36
• 2.1.5 酶、抗生素、及各种生物化学试剂36-37
• 2.1.6 仪器设备和耗材37
• 2.1.7 引物合成和序列测定37
• 2.1.8 培养基37-39
• 2.1.9 PNS营养液成分39-40
• 2.1.10 抗生素及其它试剂的配制40
• 2.1.11 溶液和缓冲液配制40-41
• 2.2 实验方法41-59
• 2.2.1 葡萄WRKY基因家族成员的鉴定和生物信息学分析41-42
• 2.2.1.1 葡萄WRKY基因家族成员的鉴定41-42
• 2.2.1.2 葡萄WRKY基因家族成员的生物信息学分析42
• 2.2.2 根瘤蚜培养和接种42-43
• 2.2.2.1 根瘤蚜室内培养42
• 2.2.2.2 根瘤蚜接种42-43
• 2.2.3 葡萄扦插苗和组培苗培养43
• 2.2.3.1 葡萄扦插苗43
• 2.2.3.2 葡萄组培苗培养43
• 2.2.4 葡萄各组织总RNA提取—CTAB法43-44
• 2.2.5 葡萄总DNA提取—CTAB法44-45
• 2.2.6 反转录cDNA第一链的合成45-46
• 2.2.7 引物设计46
• 2.2.8 半定量RT-PCR和实时定量PCR46-47
• 2.2.8.1 半定量RT-PCR46
• 2.2.8.2 qRT-PCR46-47
• 2.2.9 cDNA末端快速扩增47-49
• 2.2.9.1 5'Race47-49
• 2.2.9.2 3'Race49
• 2.2.10 基因克隆49
• 2.2.11 琼脂糖凝胶中DNA的回收49-50
• 2.2.12 克隆载体构建50
• 2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化50-51
• 2.2.13.1 感受态细胞的制备50-51
• 2.2.13.2 感受态细胞的转化51
• 2.2.14 根癌农杆菌（LBA4404和GV3101）感受态细胞的制备与转化51-52
• 2.2.14.1 农杆菌感受态细胞的制备51-52
• 2.2.14.2 农杆菌感受态细胞的转化—冻融热击法52
• 2.2.15 菌落PCR检测阳性菌落52
• 2.2.16 质粒DNA的提取52-53
• 2.2.17 质粒DNA的酶切—快速酶切53
• 2.2.18 表达载体的构建53-55
• 2.2.18.1 GFP融合蛋白表达载体的构建53-54
• 2.2.18.2 GUS表达载体的构建54
• 2.2.18.3 过表达载体的构建54-55
• 2.2.19 农杆菌介导的洋葱内表皮细胞的亚细胞定位55
• 2.2.20 农杆菌介导的瞬时同源转录激活55-56
• 2.2.21 葡萄胚性愈伤的转化56
• 2.2.22 酵母单杂交试验56-59
• 2.2.22.1 酵母感受态细胞的制备—Y18756-57
• 2.2.22.2 载体pHis2转化57
• 2.2.22.3 筛选抑制HIS本底表达的 3-AT浓度57
• 2.2.22.4 互作验证57-59
• 3 结果与分析59-96
• 3.1 葡萄（Vitis vinifera L.）WRKY家族成员的鉴定和生物信息学分析59-69
• 3.1.1 葡萄（Vitis vinifera L.）包含63个WRKY基因59-62
• 3.1.2 葡萄WRKY蛋白系统进化关系分析和分类62-63
• 3.1.3 葡萄WRKY的染色体定位及亚细胞定位预测63-64
• 3.1.4 葡萄WRKY蛋白保守域和基因结构分析64-69
• 3.2 葡萄WRKY基因在发育果实中的组织表达特性69-72
• 3.2.1 VvWRKY在葡萄发育果实各组织中的表达70-71
• 3.2.2 抗病相关PR基因在发育的葡萄果实中的表达71-72
• 3.3 根瘤蚜刺吸影响敏感型品种克瑞森根系VvWRKY基因的表达72-75
• 3.3.1 克瑞森根系VvWRKY基因响应根瘤蚜刺吸侵害72-74
• 3.3.2 荧光定量PCR进一步验证试验结果74-75
• 3.4 根瘤蚜刺吸影响中抗砧木品种 1103P根系VvWRKY基因的表达75-77
• 3.4.1 1103P根系VvWRKYs基因的表达变化75-76
• 3.4.2 接种方法验证76-77
• 3.5 启动子响应验证77
• 3.5.1 启动子克隆77
• 3.5.2 同源转基因验证77
• 3.6 根结形成过程中VvWRKYs基因在Crimson Seedless和 1103P根系中的表达变化77-79
• 3.7 VvWRKYs基因在不同敏感型葡萄中的组织表达特异性79-80
• 3.8 葡萄-根瘤蚜互作与植物内源激素SA和JA的关系80-85
• 3.8.1 根瘤蚜刺吸对葡萄SA和JA信号途径相关基因表达量的影响80-82
• 3.8.2 根结形成过程中SA相关基因的表达变化82-83
• 3.8.3 外源植物激素SA和JA对根瘤蚜成活率的影响83-84
• 3.8.4 根瘤蚜刺吸影响 1103P根系SA含量84
• 3.8.5 SA相关基因启动子序列分析84-85
• 3.9 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因的克隆85-86
• 3.9.1 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因Race全长85-86
• 3.9.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因全长克隆86
• 3.10 VvWRKY40-1 和VvWRKY46的亚细胞定位86-87
• 3.11 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白具有转录激活活性87-92
• 3.11.1 葡萄叶片同源转录激活验证87-90
• 3.11.2 酵母单杂交转录激活验证90-92
• 3.12 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白与VvCHI1B、VvCHI1B1、Vv G1基因启动子互作验证92-96
• 3.12.1 体外验证试验93-95
• 3.12.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白分别与VvCHI1B基因启动子互作95-96
• 4 讨论96-102
• 4.1 根瘤蚜侵害改变葡萄WRKY基因转录本96-97
• 4.2 WRKY转录因子正/负调节植物防御反应97-98
• 4.3 WRKY调控SA信号途径参与葡萄-根瘤蚜之间的互作98-99
• 4.4 植物PR基因的抗虫作用99-100
• 4.5 WRKY调节植物PR基因的表达100-102
• 5 结论102-103
• 参考文献103-124
• 附录124-132
• 攻读学位期间发表的论文132-133
• 致谢133-134

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本文编号：977749