水稻细菌性褐条病菌致病机理及其氧胁迫相关基因簇调控蛋白TetR的功能分析

发布时间：2017-10-09 07:15

  本文关键词：水稻细菌性褐条病菌致病机理及其氧胁迫相关基因簇调控蛋白TetR的功能分析

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【摘要】：水稻细菌性褐条病是水稻的常见病害之一,其病原细菌为稻嗜酸菌Acidovorax oryzae,它是一种革兰氏阴性植物致病菌。尽管这种病害已在世界范围内引起了较严重的水稻产量、质量和经济损失,但目前对该细菌在分子和细胞水平的致病机理及生理特性的认知仍然不够详尽。 近年来的研究表明,Ⅳ型菌毛与细菌的致病性等生理生化性状有紧密联系,此外,细菌Ⅵ型分泌系统是近些年才被发现和归纳的一类新型分泌系统,它也与细菌的致病性密切相关。本实验对Ⅳ型菌毛中重要基因pilP的功能展开详细研究,证明了pilP基因能够在细菌的致病性、游动能力、菌毛形成和生物膜形成等方面发挥重要影响；基于蛋白质质谱分析和生物信息学比对等方法,本实验室先前已经发现了在Acidovorax oryzae RS-1菌株中也存在着Ⅵ型分泌系统的结构,但是对于其中的关键组分icmF基因与dotU基因所发挥的功能和他们之间的关系并不明确。因此,本研究通过构造基因功能缺失突变体,证明了缺失了icmF基因或者dotU基因的突变体,其致病能力大为减弱,表明RS-1中的Ⅵ型分泌系统同样会影响细菌的致病性,又通过细菌双杂交实验和双分子荧光互补实验证实了icmF基因与dotU基因之间存在相互作用。 通过将A. oryzae RS-1的基因组与它的两个近缘菌株A. oryzae ATCC19860和A. citrulli AAC00-1进行比对,发现了存在于RS-1上的一个与活性氧胁迫相关的基因簇,系统发育树分析表明该基因簇是通过Pseudonymous菌基因水平转移获得的。在该基因簇上存在一个转录调控基因tetR,通过构建突变体,研究分析表明此基因所编码的蛋白在基因簇中起到抑制子的功能,该基因缺失后细胞对于活性氧的耐受能力增强,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的酶活性也有所升高。荧光定量PCR表明tetR基因可以影响到该基因簇上其他基因以及超氧化物歧化酶和过氧化氢酶相关基因的表达,这也为tetR基因缺失菌株的相关生理变化提供了合理的解释和证明。从凝胶阻滞实验结果分析TetR蛋白可以直接结合到该基因簇的启动子区域从而进行调控。质谱分析结果表明TetR蛋白能够影响共计111个细胞质蛋白的表达,通过COG分析,将这些差异蛋白的功能进行归纳总结,发现了这些差异蛋白其功能大多与细胞的能量代谢和转换、细胞移动能力、转录后修饰、以及细胞分裂有关。这项结果更加印证了tetR基因缺失后细菌的生理变化,也为研究A. oryzae提供了更详细的依据。综上,TetR蛋白作为转录抑制子,可以通过调控A. oryzae中一系列基因的表达,从而影响该细菌对活性氧胁迫环境的适应性,这种反馈调节机制在细菌进化过程中起到重要的作用。
【关键词】：稻嗜酸菌 致病性 pilP基因 六型分泌系统 TetR蛋白 活性氧胁迫
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.4
【目录】：

• 目录6-9
• 致谢9-12
• 序言12-13
• 摘要13-15
• ABSTRACT15-17
• 1 绪论17-33
• 1.1 水稻细菌性褐条病及其致病细菌17-19
• 1.1.1 水稻细菌性褐条病的发生与危害及其病原物17-18
• 1.1.2 水稻细菌性褐条病的防治18-19
• 1.2 细菌Ⅳ型菌毛19-23
• 1.2.1 细菌菌毛的生理功能和分类19-20
• 1.2.2 细菌Ⅳ型菌毛的相关基因及研究进展20-22
• 1.2.3 细菌Ⅳ型菌毛与细菌的游动性、生物膜形成以及致病性的关系22-23
• 1.3 细菌的Ⅵ型分泌系统23-27
• 1.3.1 细菌的分泌系统和Ⅵ型分泌系统的发现23-24
• 1.3.2 T6SS的结构组成24-27
• 1.4 细菌基因组进化过程中的基因水平转移27-29
• 1.4.1 基因组进化过程中的基因水平转移机制27
• 1.4.2 细菌基因水平转移的方式27-28
• 1.4.3 细菌基因水平转移的检测方法28-29
• 1.5 TetR调控蛋白与氧胁迫环境29-31
• 1.5.1 氧胁迫环境(Oxidative Stress)29-30
• 1.5.2 TetR蛋白质家族30-31
• 1.6 本研究的内容和意义31-33
• 2 材料与方法33-58
• 2.1 实验材料和试剂33-35
• 2.1.1 实验菌株、质粒载体和试剂33
• 2.1.2 实验试剂和培养基33-35
• 2.2 常规实验操作35-41
• 2.2.1 常规 PCR35-36
• 2.2.2 酶切和连接反应体系36
• 2.2.3 热激、电击和滤膜杂交转化实验36-38
• 2.2.4 质粒提取、细菌基因组DNA提取38-40
• 2.2.5 地高辛标记探针的Southern杂交(Southern Blot)40-41
• 2.3 A. oryzae突变体的构建和回补41-44
• 2.3.1 单交换同源重组构建pilP、icmF、dotU基因的插入突变41-42
• 2.3.2 双交换同源重组构建tetR基因的缺失突变42-44
• 2.4 接种实验和细菌致病性测定44
• 2.5 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae中pilP基因的生物学性状测定44-45
• 2.5.1 生物膜测定44-45
• 2.5.2 细菌游动性测定45
• 2.5.3 菌落形态的透射电镜观察(Transmission electron microscopy,TEM)45
• 2.6 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae中icmF和dotU基因的相互作用研究45-48
• 2.6.1 双分子荧光互补(Biomolecular Fluorescence Complementation,BiFC)45-47
• 2.6.2 细菌双杂交(Bacterial two-hybrid,BACTH)47-48
• 2.7 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae RS-1中tetR基因和所在基因簇的功能分析48-58
• 2.7.1 比较基因组和构建系统发育树48
• 2.7.2 细胞在不同浓度氧胁迫环境下的存活率测定48-49
• 2.7.3 细胞质蛋白的提取、1D蛋白质电泳和质谱49-52
• 2.7.4 SOD和CAT酶活性测定52
• 2.7.5 Real-Time PCR检测52-54
• 2.7.6 TetR蛋白的表达纯化54-55
• 2.7.7 凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA)55-58
• 3 结果与分析58-87
• 3.1 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae中pilP基因的功能鉴定58-65
• 3.1.1 敲除pilP基因后,A. oryzae致病性显著下降59-61
• 3.1.2 pilP基因缺失后,细菌丧失菌圈和Ⅳ型菌毛61-63
• 3.1.3 pilP基因能够影响A. oryzae的游动性及生物膜形成63-65
• 3.1.4 pilP基因在A. oryzae上的功能小结65
• 3.2 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae中icmF和dotU基因的相互作用65-70
• 3.2.1 T6SS能够影响A. oryzae细菌致病性65-68
• 3.2.2 icmF和dotU基因的互作68-70
• 3.3 水稻细菌性褐条病菌A. oryzae中氧胁迫相关基因簇的发现以及tetR转录调控基因的功能分析70-87
• 3.3.1 tetR转录调控基因及其所在的基因簇的发现70-74
• 3.3.2 tetR基因突变体对活性氧胁迫的耐受力增强74-78
• 3.3.3 tetR基因突变后,A. oryzae菌中SOD和CAT酶的活性升高78-79
• 3.3.4 通过LC-MS/MS质谱鉴定受TetR蛋白调控的其他细胞质蛋白79-82
• 3.3.5 荧光定量PCR分析TetR调控蛋白对其他基因表达的影响82-83
• 3.3.6 TetR蛋白能够直接结合在pqiA'和tetR之间的启动子区域83-85
• 3.3.7 TetR蛋白的功能总结85-87
• 4 讨论87-91
• 5 全文总结91-93
• 5.1 A. oryzae RS-1的致病机制研究91
• 5.2 A. oryzae RS-1中活性氧胁迫相关基因簇和调控蛋白TetR91-93
• 参考文献93-106
• 附录106-123
• 附录1 本研究用到的菌株和质粒106-109
• 附录2 本研究用到的PCR引物列表109-111
• 附录3 蛋白质质谱鉴定出的RS-1和RS-tetR之间的差异蛋白111-117
• 附录4 本研究所用到的载体图谱117-123
• 作者简介123
• 主要发表论文123

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：998844