核酸探针与光学生物传感的新方法研究

发布时间：2020-08-02 12:13

【摘要】：生物传感器作为快速灵敏检测生物分子的工具一直以来都是生命科学和分析化学领域十分关注的课题。光学传感技术因具有灵敏度高、操作简便、无需分离、可实现实时测定等优点,被广泛应用于生物分子的检测,如酶活性、蛋白质、核酸和生物小分子等。此外,核酸探针因其序列多变、识别多样化、稳定等优点在生物传感与生化分析新方法建立方面引起了广泛的关注。在大量文献调研的基础上,本论文结合多种构型的核酸探针和光学分析方法构建了几种光学生物传感新方法用于检测聚核苷酸激酶(PNK)活性,mi RNA以及与致病基因相关的DNA序列。与传统方法比较,本论文所建立的传感策略操作简便,灵敏度高,检测成本低,可实现实时测定。具体工作内容如下:在第二章中,通过实时监测依赖于磷酸化的DNA连接反应,我们构建了一种无标记的生物发光传感器用于PNK活性的检测。在该传感策略中,设计了两个带有5’突出端的发夹DNA探针作为磷酸化受体,同时广泛应用的磷酸供体ATP被d CTP取代。当不存在PNK时,由于发夹探针5’端缺乏磷酸基团而不能引发连接反应,显示出较弱的背景信号。加入PNK时,使两探针发生磷酸化而引发连接反应,同时释放出AMP,随后将AMP转换为ATP,在荧光素酶作用下产生明显的生物发光信号,通过生物发光信号的连续监测可实现PNK活性的实时检测。该检测方法操作简便,无需标记,成本低廉,免受生物基质自身荧光的干扰,还可以进一步用于PNK的定量、动力学及抑制剂研究。在第三章中,我们基于目标分子引发杂交链式反应(HCR)辅助的连接反应,通过生物发光法检测连接反应释放出的AMP,发展了一种新的高灵敏的mi RNA均相检测方法。当存在靶mi RNA时,它可有效的引发两发夹探针之间的HCR,形成带有切口的长链DNA聚合物,这些切口可被连接酶共价连接,释放出AMP产生发光信号,从而实现mi RNA的定量分析。HCR的引入不仅提高了检测的灵敏度,而且通过核酸探针的特殊设计可为其它生物分子的检测提供潜在平台。重要的是,生物发光实验以靶依赖连接副产物AMP转换的ATP作为报告基团,无需复杂的荧光素酶标记、固定、分离等步骤。该方法具有操作简单,成本低廉,高通量,高灵敏等优点,在实际检测中有很大的应用价值。在第四章中,将纳米金的重力和聚合酶的识别作用相结合,构建了一种简单的荧光传感方法用于靶DNA序列检测,并选用与致病基因相关的p53序列为模型。首先,将巯基修饰的引物通过S-Au自组装到Au NP上,当存在目标DNA时,探针与目标DNA的部分序列杂交,生成的不对称产物在Taq DNA聚合酶和d NTPs的辅助下,延伸形成稳定的ds DNA螺旋结构。最后,在连接酶的作用下将其与带有荧光分子的ds FAM连接,离心后在沉淀中可以观察到明显的荧光信号,而上清液中的信号基本可以忽略。作为对照,当目标DNA序列中存在单碱基错配或为任意序列时,则不能发生杂交、延伸、连接反应,从而使沉淀中基本无明显荧光信号。该检测方法不仅具有操作简便,响应快,选择性高的优点,而且还可用于相关酶活性的检测。
【学位授予单位】：西北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O657.3;TP212.3
【图文】：

生物传感器,工作原理图,光学信号,电子信号

生物传感器的工作原理图

生物传感,光学,工作原理,方法

速度快、分析灵敏度高、选择性高、抗电子干扰强等特点被广泛生物分析中。其主要是通过将待测物质与识别单元结合过程中产号，通过换能器转变为电信号, 再经放大处理获得最终的输出信号目标的定性和定量分析，工作原理如图 1.2 所示。

示意图,荧光光谱分析,环扩,原理

种灵敏检测 T4 PNK 活性及其抑制剂的方法，如图 1.3B 所示。基于滚环扩增的荧光核酸测定技术也得到了不断的发展。Liu 等人[22]以 SYBR Green I 作为荧光指示剂，结合 T4 RNA ligase 2 能够特异性区分单核苷酸多态性、滚环扩增技术发展了一种灵敏度高、选择性高的 miRNA 分析检测方法，如图 1.3C所示。

【参考文献】