纳米孔检测系统的研制及其在单分子检测中的应用

发布时间：2018-10-22 10:24

【摘要】：纳米孔传感检测技术自1996年一经提出就被证实是一种强有力的快速非标记单分子检测的技术。由于该技术有着高灵敏、快速、非标记识别DNA分子中四种碱基的潜能,纳米孔有望开辟一种新的无需扩增和标记的DNA测序技术,被认为是最有可能实现将DNA测序成本降至100美元的技术之一。目前,除了核酸,蛋白质等生物多聚物之外,纳米孔检测技术已被广泛应用于纳米颗粒、病毒颗粒的尺寸和表面理化性质的表征。这些研究结果使得科学家们更加坚信,纳米孔作为单分子检测技术的一个平台,必将发展成为一种低成本的测序方法以及高灵敏的生物传感检测技术。在纳米孔单分子DNA测序应用中,由于DNA分子存在在随机的折叠或螺旋卷曲,在其通过纳米孔时会对检测的电流信号产生影响。目前还缺乏一种行之有效的方法和理论来理解螺旋卷曲的DNA分子在通过纳米孔时的动态学行为以及其对电流信号产生的影响,所得信号的阻塞电流及过孔持续时间分布都显现出复查的非高斯型分布,从而很难通过单一电流信号去识别DNA序列信息及高灵敏的传感检测。本课题着眼于提高固态纳米孔的检测精度,先后探索了DNA分子、纳米材料以及刚性杆状病毒颗粒通过固态纳米孔的信号特征及规律。通过研究λ-DNA的信号特征,证实DNA分子的折叠和螺旋结构会对信号产生不确定的影响。为更好地理解和分析DNA分子通过纳米孔的动态学行为,本课题从结构单元出发,通过研究球形金纳米颗粒(AuNPs)、刚性杆状烟草花叶病毒(TMV)通过固态纳米孔的信号特征,阐述分析物的几何形状、尺寸、表面电荷、柔性等对其通过纳米孔时的动态行为及相应的电流信号的影响,以期望找到影响其相应检测精度的主要因素,为固态纳米孔更精确的应用于DNA测序、纳米材料以病毒颗粒的传感检测提供理论指导。1、纳米孔的检测系统的构建本课题在基于国际上常用的膜片钳电流放大器作为电流放大和检测设备,结合其相应的数据采集卡1440A作为数据的采集设备,研究纳米孔传感检测系统中各组成部分的连接及相互工作方式,确定了一套完整而有效的电磁屏蔽方法。同时,根据不同实验需要,设计并制作了合理而简便的纳米孔检测流体装置,既能满足操作简便的要求,又能最大程度的减少实验所需试剂量及噪声。2、λ-DNA分子通过纳米孔的信号检测及分析首次利用FIB制备的尖端30 nm尾端60 nm的锥形纳米孔研究λ-DNA在200至450 mV下通过该孔时的信号特征及规律,建立一套完整的数据提取和分析方法。系统地研究了λ-DNA通过该纳米孔的阻塞电流、过孔持续时间以及过孔事件频率与电压的相互关系。成功地检测了λ-DNA的过孔信号及其构象。同时我们发现增加电压可以显著地提高事件频率以及拉伸超螺旋的DNA分子。相较于6-30 nm的超薄纳米孔,我们也发现λ-DNA通过该孔存在一个181 mV的阈值电压,这与孔的形状和厚度有关。本实验中λ-DNA的速度减慢了5倍,而捕获半径扩大了两倍。其结果表明大孔径且长的锥形纳米孔不仅稳定性更高,检测通量大,并且其检测精度依然较高。然而我们也发现λ-DNA通过纳米孔时存在随机的折叠,使得我们测得的阻塞电流呈现出多水平,同时其过孔速度也成非线性状态。为了更好理解DNA通过纳米孔的动态学行为,由于DNA局部(50 nm)可以视为刚性的杆,而整体视为柔性的线,因此将一条长链DNA视为由球连接多个短的刚性杆是一种简单而有效模拟DNA的方法。基于此,我们后续采用结构简单的金纳米颗粒和杆状病毒,系统地研究其分析物的形状与柔性对其通过纳米孔的动力学过程的影响。3、金纳米颗粒以及与DNA分子结合体通过纳米孔的信号检测及分析本实验中,我们首次报道到了AuNPs-DNA结合体在低盐和0.5 M KCl溶液下通过60 nm的纳米孔时分别产生了双阶事件以及非对称的拖尾事件。我们发现AuNPs-DNA结合体该孔时产生了一个电场依赖性的电导变化以及一个非线性电泳现象；同时在低盐溶液中所产生的电导变化的相对误差也较高盐溶液要小。因此,我们基于电场诱导电荷及AuNPs上结合的DNA的结构的变化研究并解释了双阶事件以及非对称的拖尾事件形成的原因。进一步我们根据非线性电泳推导出了纳米颗粒通过纳米孔所引起的电导变化的近似计算公式,而后系统地研究了盐离子浓度、施加的电压以及颗粒的尺寸大小对纳米孔电导变化的影响。本研究结果表明固态纳米孔不仅可以用于纳米颗粒的尺寸表征,还可以成为一种更简单而有力的研究和观察单个纳米颗粒非线性电泳的平台。这一研究将为用金纳米颗粒一分析物检测技术与纳米孔检测的联合来检测目的片段或分析物提供有价值的建议,并且为纳米孔用以表征纳米颗粒的表面性质打开了新的一扇门。4、烟草花叶病毒通过纳米孔的信号检测及分析首次实现将刚性的杆状植物病毒(TMV)通过不同的孔径的氮化硅纳米孔。有趣的是,由于TMV的刚性很强,我们观察到了三类TMV通过纳米孔事件,其次我们发现在TMV过孔事件平台期中存在着一个很强的电流的波动。由此我们结合粗粒化的朗之万动态模拟(coarse-grained Langevin Dynamics)提出了TMV通过固态纳米孔的动力学模型。基于这一模型,我们可以通过其过孔事件的电流特性推测其过孔时相应的行为。随后我们系统的研究了TMV在孔外寻找入口时的孔外阻塞接触电导△Gacc、TMV竖直过孔的阻塞电导AGo以及TMV旋转对电导变化的影响,发现了一个孔径依赖性的△Gacc及电导波动范围。最后,我们研究了TMV在通过纳米孔的过程中的旋转频率,其结果表明TMV在过孔的时候有旋转成平行电场的趋势。本课题的研究将会给检测杆状病毒以及研究纳米孔过孔行为的动态学带来新的启示；结合之前的DNA以及半刚性半柔性的fd病毒,本课题也提出了一种新型的用纳米孔来检测样品的刚性的办法。综上所述,本课题通过研究λ-DNA通过固态纳米孔实验,证实DNA分子的折叠和螺旋结构会对信号产生不确定的影响,结合AuNPs以及TMV通过纳米孔的动态学行为及其信号特征与规律,系统地研究并解释了目标分析物的表面电荷、形态改变、与孔壁的相互作用以及在过孔时的摆动对纳米孔电流信号的影响,为固态纳米孔更精确的应用于DNA测序、纳米材料以病毒颗粒的传感检测提供理论参考。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450;TP212.3

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