TAK1抑制剂NG25增强阿霉素诱导乳腺癌细胞凋亡作用机制研究

发布时间：2018-03-19 18:20

本文选题：TAK1抑制剂　切入点：化疗　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着对乳腺癌认识的不断加深,目前认为乳腺癌是一种异质性疾病。不同乳腺癌类型具有不同的基因背景,不同的生物学行为,不同的形态学表现,以及不同的临床转归和预后。世界范围内,乳腺癌在女性中的发病率是22%,而在西方国家这个比例甚至更高,达到所有女性中的26%。从而使乳腺癌成为女性中发病率最高的恶性肿瘤。在北美,欧洲以及澳大利亚等发达国家的人口中,大约有6%的女性会在75岁之前诊断为浸润性乳腺癌。但随着局部治疗的逐渐完善以及系统性全身治疗的结合乳腺癌的死亡率在西方社会呈逐年下降的趋势。其中针对不同的乳腺癌类型的特异性的治疗方式明显的改善了患者的生存期。这其中包括针对雌激素及孕激素受体阳性的患者所给予的内分泌治疗,同样包括针对人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor2,HER-2)阳性的患者基于的抗HER-2靶向治疗使一部分患者在总生存和无病生存方面获得收益。虽然特异性较高的靶向治疗在乳腺癌的治疗中发挥了重要的作用,但是,对于进展期乳腺癌,尤其是预后较差的三阴性乳腺癌来说,全身系统性的化疗任然是这部分乳腺癌患者治疗的基石。其中阿霉素作为一种全身性的化疗药物,在乳腺癌的治疗中应用广泛。在2016年的NCCN乳腺癌治疗指南中,含有阿霉素的辅助化疗方案作为一线的乳腺癌化疗方案被推荐用于临床乳腺癌患者的治疗中。尤其是对于预后较差的HER-2过表达型以及三阴型乳腺癌患者。但是因为阿霉素的进行性的计量依赖性的心脏毒性严重的限制了他的临床应用。临床上通过应用脂质体阿霉素以及在应用阿霉素时加用心脏保护药物如右丙亚胺从而来降低阿霉素的心脏毒性。取得了有限的临床效果。因此为了获得更好的治疗效果,找到新的方法来降低阿霉素的心脏毒性,从而增加阿霉素的治疗效果是十分迫切的。TAK1是在1995年首先被发现的,他是线粒体激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族的成员之一,可以被TGF-β和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)激活。最近的研究表明,TAK1可以通过激活IKK-NF-k B通路发挥比较强大的促进增值的作用。除此之外,TAK1还可以通过磷酸化的方式激活MAPKKs,从而导致MAPKs的激活,包括ERK,p38和JNK。NF-k B和MAPKs的激活会诱导下游炎症因子和抗凋亡蛋白的表达,从而对细胞起到抗凋亡和促进增值的作用。更进一步有研究发现增高的NF-k B活性可以使肿瘤细胞产生对化疗,内分泌治疗以及放疗的抗性。由于TAK1在癌症发展以及肿瘤耐药的产生中发挥重要的作用,因此针对TAK1作为一个可行的治疗靶点的研究在不同的恶性肿瘤中都得到了广泛的开展。目前在胰腺癌,乳腺癌,结肠癌以及非小细胞肺癌中都有针对TAK1作为治疗靶点的研究。在以往的研究中我们发现,肿瘤细胞在遇到一些基因毒性药物的杀伤时,会启动本身的NF-k B通路,上调NF-k B通路的活性,来抵抗基因毒性药物的杀伤。而在NF-k B通路激活的过程中,TAK1作为这条通路激活的一个介导分子,发挥着十分关键的作用。因此有研究者应用TAK1的抑制剂5Z-7-oxozeaenol(5Z-7)来增强阿霉素在神精母细胞瘤中的治疗作用。5Z-7是一种不可逆的ATP竞争性TAK1抑制剂,主要由真菌分泌提纯而成,获得相对困难,因此价格比较昂贵。这就限制了5Z-7作为一种药物应用于临床的可能性。最近的研究发现,在乳腺癌当中5Z-7同样可以抑制TAK1的活性,从而导致下游的分子活性受抑制,包括p38,IKK等。更进一步的体内实验研究发现,通过敲除TAK1相关性分子1(TAK1-associated molecule 1,TAB1)能够抑制TAK1的活性,从而明显的抑制了乳腺肿瘤细胞在实验动物体内的生长和远处转移。基于以上的研究结果我们推断,通过抑制TAK1的活性应该可以增强阿霉素对于乳腺癌的细胞毒性作用。NG25是一种人工合成的2型TAK1抑制剂,他能够结合到目标激酶的ATP结合位点上,从而达到抑制TAK1活性的作用。与5Z-7相比,NG25最大的优势在于他的价格比较廉价,比较容易获得。相比于5Z-7可能具有更大的临床应用前景。最近有多个研究都证明了NG25能够有效的抑制TAK1的活性。这些研究主要是针对在炎症的过程中来探讨NG25对于TAK1的抑制作用,然而对于NG25的活性,还没有学者在肿瘤中进行验证。在我们这个基础研究中,我们应用了多个乳腺癌细胞系来验证NG25的细胞毒性作用,同时进一步探讨了在乳腺癌中NG25对于阿霉素细胞毒性的增强作用。我们应用的乳腺癌细胞系包括不同的乳腺癌类型,主要包括了HER-2过表达及三阴型这两个预后最差的乳腺癌类型。TAK1是一种细胞内锚分子,他同时调节NF-k B通路和MAPK通路。在细胞生存中起着非常重要的作用,同时还能促进肿瘤细胞的转移和抗药性的产生。前期有部分学者的研究工作显示,TAK1可能是一个比较有前景的肿瘤治疗的靶点。在胰腺癌的治疗研究中,有学者发现通过RNA干扰技术沉默TAK1或者是通过口服TAK1的抑制剂LYTAK1能够增强奥沙利铂和吉西他滨的细胞杀伤作用,从而增强这两个化疗药物在体外实验中对胰腺癌细胞的细胞毒性作用。同样也有研究者发现在乳腺癌中通过抑制TAK1的活性能够增加拓扑异构酶抑制剂的活性。此外,有研究者应用TAK1的抑制剂5Z-7来增强阿霉素和依托泊苷在神精母细胞瘤中的细胞毒性作用。5Z-7是一种从真菌中分离出来的TAK1一直剂,价格昂贵获得比较困难。更进一步,有学者研究发现在KRAS依赖性的结肠癌中,通过抑制TAK1具有一定的促进肿瘤细胞凋亡的作用。那么关于TAK1的最新的研究发现,研究中通过应用微小RNA-26b抑制肿瘤细胞内TAK1和TAB3的活性,降低了肿瘤细胞中NF-k B的活性,从而增强了肝癌细胞的化疗敏感性。这些研究都显示了TAK1作为多种恶性肿瘤的治疗靶点的可行性以及相应的应用前景。与上述的研究结果一致,我们的研究发现,通过应用一种人工合成的TAK1抑制剂NG25,能够增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。这种所用是通过降低NF-k B通路的活性而发挥的作用。因此在我们的研究中,通过应用多个成熟的乳腺癌细胞系我们证明了NG25能够抑制TAK1的活性,从而增强阿霉素诱导的乳腺癌细胞的凋亡。这个研究中所应用的乳腺癌细胞系涵盖了不同的乳腺癌的分子亚型,所得出的实验结果具有一定的代表性和普遍性。因此具有较大的使用价值。在本研究中,选取了五种乳腺癌细胞株,包括MDA-MB-231和BT549代表了三阴性乳腺癌、还有MCF7和T-47D代表了激素受体阳性的乳腺癌,另外还有HCC-1954代表了HER-2过表达的乳腺癌。NF-k B是一个关键的细胞内转录因子,具有多样的生物学活性,增加细胞活性、增加肿瘤细胞对各种治疗的抗性、增加肿瘤细胞转移的能力。因此NFk B在各种肿瘤中都得到了广泛的研究。NF-k B可以被多种刺激因素激活,包括各种应激以及对肿瘤细胞基因组的各种损伤因素。阿霉素作为一种化疗药物在多种恶性肿瘤的治疗中都得到广泛的应用。他主要的杀伤肿瘤细胞的作用机制主要有两个方面。第一阿霉素可以通过干扰DNA拓扑异构酶Ⅱα从而诱导肿瘤细胞走向凋亡,另外一方面阿霉素可以导致肿瘤细胞的DNA双链破裂,导致肿瘤细胞的DNA发生不可逆的损伤从而达到杀死肿瘤细胞的目的。在这种情况下,肿瘤细胞的NF-k B通路会被激活,激活的NF-k B会通过作用于ATM、肿瘤抑制基因和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene 2,BRCA2)来达到肿瘤细胞损伤DNA的自我修复。在本研究中,我们发现NG25能够抑制阿霉素引起的NF-k B通路的激活。从而抑制NF-k B激活后所介导的肿瘤细胞的自我修复。达到增强阿霉素对乳腺癌细胞的杀伤作用的目的。在研究中我们通过检测Ik Bα的水平证实了NG25能够通过抑制TAK1的活性来抑制NF-k B通路的激活。而这个潜在的机制可能是NG25在乳腺癌细胞中发挥生物学活性的主要机制。除此之外,我们同样检测到TAK1介导的MAPK通路的激活也可以被NG25部分阻断,乳腺癌中MAPK通路的部分阻断在NG25发挥药物活性的过程中也可能起到一定的作用。综上所述,通过实验研究的总结,我们得出结论,TAK1的激酶活性可以被NG25阻断,从而降低NF-k B通路以及MAPK通路的活性,最终增加阿霉素在乳腺癌治疗中的药物疗效。在乳腺癌细胞的体外实验中,阿霉素联合NG25可以增强阿霉素化疗效果,从而降低阿霉素在化疗过程中的药物剂量而达到降低药物副作用的目的。随着乳腺癌临床以及基础研究的不断加深,人们对乳腺癌的认识趋于成熟。现在的主流观点认为乳腺癌是一种异质性疾病,目前临床上主要分为4个主要的分子亚型。包括腔面A型(Luminal A)、腔面B型(Luminal B)、HER-2过表达型(HER-2 positive)和三阴型(triple negative)。每一种亚型都有特异的基因水平的分子改变,从而导致不同的生物学行为及临床预后。但在不同的分子亚型的乳腺癌当中,也有一些共同的分子生物学特点。复习文献我们发现在多数的乳腺癌病例中,都可以看到NF-k B通路的持续性激活,而NFk B通路早已被证明是一个促进肿瘤细胞存活、增殖的重要通路。更进一步的研究发现,在患者的乳腺癌肿瘤组织中能够检测到磷酸化的TAK1表达,证明了TAK1在乳腺癌肿瘤组织中的持续性表达。进一步的实验动物的体内实验显示通过RNAi技术敲除TAB1来抑制TAK1的活性能够明显抑制乳腺癌肿瘤在实验动物体内的增长和远处转移。提示诊断乳腺癌来说TAK1很有可能是一个比较有潜力的治疗靶点。在我们的研究当中,我们发现,NG25SX药在不同的乳腺癌细胞系当中显示出了剂量依赖性的细胞毒性,但是在不同的细胞系当中药物的效用性略有不同。值得一提的一点是,有研究发现在侵袭及转移能力较强的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,TAK1组成性表达的水平要明显高于侵袭能力较弱临床预后略好的腔面A型的乳腺癌细胞系MCF7。和上述的研究结果一致,我们在实验中发现NG25对于MDA-MB-231的抑制能力要明显高于对MCF7抑制能力,这些结果给我们的提示是,对于具有高度侵袭能力的三阴性乳腺癌来说,TAK1可能更具有价值的治疗靶点。通过靶向抑制TAK1的生物活性从而解决肿瘤细胞的化疗耐药问题已经在胰腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌等恶性程度较高的肿瘤中有过尝试和报道,所得到的也都是阳性结果。在乳腺癌当中,也有学者通过抑制TAK1的活性来解决肿瘤放射性治疗抵抗的问题。在我们的研究中,通过实验的反复验证,有充分的证据支持在不同的乳腺癌细胞系当中,NG25都能够增强阿霉素的肿瘤细胞杀伤作用。这个现象在不同分子亚型的乳腺癌细胞系中都是一致的。因此,TAK1激酶生物活性的抑制,很可能是一个来客服肿瘤细胞化疗耐药的治疗策略。综上所述,本研究通过不同人乳腺癌细胞株研究证明了TAK1抑制剂NG25能够通过抑制TAK1的活性,抑制阿霉素介导的NF-k B通路和MAPK通路的激活,从而增加阿霉素在不同乳腺癌细胞系当中的肿瘤细胞杀伤作用。在本研究中我们提供的数据足以说明NG25能够抑制TAK1介导的NF-k B的活化,从而增加阿霉素的化疗效果,降低阿霉素的临床应用剂量,减小阿霉素的心脏毒性。因此具有一定的临床价值,需要进一步研究。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

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