“黄芪—葛根”药对对乙醇诱导的胃粘膜损伤的保护
研究背景：近年来我国饮酒人群的数量以及酒精消费数量逐年增加,因饮酒引起的消化系统疾病,已经成为一个严重的社会问题与医学问题。饮酒导致的消化系统疾病多为胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、酒精性肝病、肝硬化等；长期饮酒还可以诱发肠上皮化生,肠上皮化生是胃粘膜病变向胃癌过度的一个阶段。药对研究是中药复方研究的重要组成部分,也是研究中药复方的一个突破口。黄芪—葛根药对首见于清代医书《证治汇补》中所记载的黄芪葛根汤,原方中黄芪与葛根的配伍比例为2：1,历代多位医家认为此方具有解酒毒的作用。前期动物实验研究发现,黄芪苷类可以减轻乙醇对胃粘膜的损伤。黄芪甲苷与黄芪总苷可以促进已损伤的胃上皮细胞GES-1的修复,其作用机制与黄芪甲苷、黄芪总苷参与细胞凋亡等相关通路有密切联系。因此本研究以黄芪—葛根药对为切入点,探讨其保护胃粘膜损伤的物质基础与相关机制。目的：优选黄芪—葛根药对保护胃粘膜损伤的最佳水煎工艺；建立黄芪—葛根药对不同配伍比例的高效液相指纹图谱,通过谱效关系的研究,明确黄芪—葛根药对中的异黄酮类成分对保护胃粘膜损伤的贡献大小；初步探讨黄芪—葛根药对保护乙醇诱导胃粘膜损伤的机制。方法：1.正交试验结合药效学实验优选黄芪—葛根药对抗乙醇诱导胃粘膜损伤最佳水煎工艺。以黄芪—葛根药对水煎液中葛根素的化学含量作为评价指标,以乙醇对小鼠胃粘膜损伤分数作为药效指标,设计正交试验,对药对煎药的时间、煎药的次数、煎药水量3个因素,分别分为3个水平进行综合考察,优选出黄芪—葛根药对(2：1配伍)保护胃粘膜的最佳水煎工艺。2.高效液相色谱法建立黄芪—葛根药对不同配伍比例(3：1、2：1、1：1、1：2、1：3)的指纹图谱；将不同配伍的黄芪—葛根药对指纹图谱共有峰相对峰面积与小鼠胃粘膜损伤分数进行灰色关联分析,通过关联度大小,明确药对中已鉴别的异黄酮类化学成分对胃粘膜保护作用的贡献度。3.观察黄芪—葛根药对对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的保护。测量并计算肉眼下胃粘膜损伤分数与光镜下病理切片胃粘膜损伤分数。HE染色病理切片观察黄芪—葛根药对对不同实验组大鼠胃粘膜损伤形态学的影响。4.观察药对对凋亡信号通路关键基因与蛋白的影响。通过Real time PCR、免疫组织化学、Western-blot法检测药对对凋亡信号通路Bcl-2/Bax/Caspase-3基因与蛋白表达的影响。结果：1.黄芪—葛根药对(2：1配伍)按照煎煮3次,每次30 min,10倍水量的水煎工艺所煎煮的药液中葛根素含量(15.90±0.04mg/mL)高于其它中药组,其小鼠胃粘膜损伤分数(14.8±11.8)低于其它给药组。黄芪—葛根药对煎煮30 min,煎煮3次,加10倍水作为本研究的最佳水煎工艺。2.黄芪—葛根药对不同配伍比例(3：1、2：1、1：1、1：2、1：3)对乙醇诱导小鼠的胃粘膜损伤均有保护作用,均可以降低小鼠胃粘膜的损伤分数,其中3：1配伍组胃粘膜损伤分数低于其它配伍组,其保护胃粘膜损伤的效果优于其它配伍组。与已知对照品比较,鉴别出黄芪—葛根药对中的8个异黄酮类化学成分分别是：染料木素、染料木苷、葛根素、毛蕊异黄酮、大豆苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素。通过将HPLC指纹图谱获得的药对共有峰峰面积与小鼠胃粘膜损伤分数相关联,得到8种异黄酮类化学成分对胃粘膜保护作用的贡献度依次为：染料木素葛根素大豆苷元大豆苷芒柄花素毛蕊异黄酮染料木苷毛蕊异黄酮葡萄糖苷。3.肉眼观察发现,正常组大鼠胃组织粘膜表面呈现淡粉色,粘膜表面连续、光滑、无破损、无充血；模型组大鼠粘膜色鲜红、呈现出线状或斑点状出血；与模型组相比较,各预防给药组粘膜损伤较轻,局部仅有少数点状出血。HE染色病理切片结果显示,正常组大鼠胃粘膜上皮细胞有很好的连续性、细胞排列紧密有序、固有层腺体排列整齐；与正常组相比较,模型组大鼠粘膜组织遭到破坏,上皮细胞脱落、坏死,腺体排列紊乱,粘膜下层水肿,腺体扩张,有红细胞外渗；阳性药(西米替丁)组与药对高剂量药组可见少量上皮细胞脱落,损伤情况均轻于模型组,药对中剂量组与药对低剂组可见上皮细胞局部脱落,粘膜损伤稍重于西药组与药对高剂量组,但均轻于模型组。4.与模型组相比,黄芪—葛根药对可以上调Bcl-2基因的mRNA的表达,下调Bax与Caspase-3基因的mRNA的表达；免疫组化与Western-blot结果显示,与模型组相比,黄芪—葛根药对可以上调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,下调促凋亡蛋白Bax与Caspase-3的表达,其中西药组与黄芪—葛根药对高剂组的效果优于药对中剂组与药对低剂组。结论：1.正交试验优选的黄芪—葛根药对最佳水煎工艺为：煎煮3次、每次30 min,10倍水量。2.黄芪—葛根药对对乙醇诱导的胃粘膜损伤具有保护作用,其中3：1配伍组保护胃粘膜损伤的效果优于其它配伍组；药对中已鉴别的8种异黄酮化合物中染料木素保护胃粘膜损伤的贡献度大于葛根素与其它异黄酮类化合物。3.黄芪—葛根药对可以减轻乙醇导致的胃粘膜出血、水肿、糜烂等病理损伤;其作用机制可能与药对参与细胞凋亡信号通路,通过上调抑凋亡基因与蛋白的表达,抑制促凋亡基因与蛋白的表达,抑制胃粘膜细胞凋亡,起到保护胃粘膜的作用。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：
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本文编号：166552
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