静电纺丝载洛伐他汀抗骨质疏松复合支架“eLTPS”的制备和体内外性能研究

发布时间：2018-03-22 14:30

本文选题：静电纺丝　切入点：骨质疏松症　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：骨质疏松症是在脊柱外科领域最常见和最具挑战的合并症之一。由于骨量减少与结构异常,合并骨质疏松症的患者发生椎间融合器沉降、椎体切割、螺钉拔出、(假关节形成导致)钉棒断裂等内固定失败的例子并不罕见。由各种因素造成的成骨细胞增殖分化功能的下降,导致骨质疏松患者在骨修复过程中的愈合能力减弱,愈合时间延长。因此,骨质疏松条件下的缺损修复理想上需要长时间的药物干预。传统的系统给药模式存在利用率相对低下的缺点;进入全身循环的药物,长期的反复作用还可能升高或直接导致患者出现肝肾功能损害、钙剂相关心脏疾病等并发症的风险;同时,除了缺损部位的骨填充材料需求,脊柱外科临床往往还需要应用额外的骨组织来帮助实现节段融合。因此,通过设计出兼具长期局部控释抗骨质疏松药物以及良好生物力学强度的复合骨支架材料,可以在对局部骨缺损支撑填充的同时,使药物在局部微环境中持续作用,则能更好的促进骨质疏松条件下的骨修复并改善局部骨组织的强度。近年来,他汀类被发现具有抑制成骨细胞的凋亡,促进成骨细胞分化,促进成骨修复,以及抑制甲羟戊酸途径从而抑制破骨细胞的分化并调节其相关功能的作用,因此被广泛认为具有重要的促进骨组织修复的以及抗骨质疏松的潜能。然而,他汀类的骨亲和力低,局部应用发挥成骨效力又具有浓度依赖性,因此需要选择适宜的的局部缓释载体。近年来,静电纺丝作为缓释药物的载体受到青睐,其优势在于经济便捷,载药容量高,生物相容性好;药物缓释持久有效且精确可控。因此,以静电纺丝作为抗骨质疏松药物的载体具有良好的潜力。然而,尽管静电纺丝本身可以形成组织支架,但难以作为可以填充支撑的骨组织支架独立应用,需要与传统骨组织工程支架相联合应用。本研究通过静电纺丝技术,将他汀类药物(洛伐他汀Lovastatin,LOV)与高分子聚合物(聚己内酯PCL)搭载形成可缓释LOV的载药纳米纱的膜片,再与β磷酸三钙(β-TCP)与PCL结合形成的的复合骨支架材料,以多层“三明治”的形式装配形成可长期缓释载抗骨质疏松药物的支架复合物(eLTPS)。通过调节他汀类载药膜片装载层数,精确控制局部微环境的药物释放,并在体外细胞实验中优化和证实其促进成骨矿化的能力,并将优化筛选的eLTPS直接应用于兔的骨质疏松动物骨缺损模型中进行外科治疗,从而进一步验证其体内的抗骨质疏松以及骨修复的能力。以期为骨质疏松条件下骨组织缺损的局部修复提供一个新的有效途径。第一部分:可缓释抗骨质疏松药物骨组织支架复合物eLTPS的制备及表征目的:通过静电纺丝技术制备可缓释具有抗骨质疏松药物的骨组织支架复合物eLTPS,并观察测量其物理化学特征,以及表面微观结构情况。方法:将LOV与PCL溶液在静电纺丝技术辅助下制备出共混纺纳米纺纱膜片“e LOV/PCL”,再与物理优化性能后的β-TCP/PCL支架通过压配形成e-LOVPCL/β-TCP/PCL复合骨组织支架(eLTPS)。以万能力学测试机检测并优化复合骨支架材料的抗压性能,以扫描电镜观察复合支架表面的微观结构,以EDS能谱仪检测材料的化学构成。结果:在静电纺丝技术辅助下,我们成功制备了载抗骨质疏松药物的复合骨支架材料eLTPS。各组材料样本的抗压性能良好,强度均超过70 MPa,其中β-TCP和PCL的比例为1:1时,抗压性能较其它组更佳(P＜0.05);EDS能谱进一步证实了材料的化学构成;电镜显示制备的支架材料表面粗糙,大量分布着可供细胞黏附生长的左右的孔隙,孔隙分布均匀,大小较为均一,孔隙直径约在250-350μm之间。结论:通过静电纺丝技术实现了抗骨质疏松药物洛伐他汀的精确搭载,在联合应用β-TCP/PCL复合支架材料后,成功制备出了具有三维多孔结构的骨组织支架复合物eLTPS。eLTPS装载不同层数的静电纺丝载药膜片,同时兼具有一定的生物力学强度,理论上适用于骨质疏松条件下骨组织缺损的局部修复。第二部分:eLTPS的体外缓释性能,生物安全性检测以及对成骨细胞分化功能的影响目的:本部分旨在研究eLTPS的药物缓释特性,检测其材料的生物安全性,以及eLTPS在体外对成骨细胞增殖和成骨功能的影响。方法:将eLTPS置于体外模拟液中,以紫外线分光光度计(UV法)测定缓释液中LOV的浓度,检测49天,比较含有不同载药丝膜层数eLTPS缓释LOV的特性,并绘制释放曲线。将eLTPS与对照组和MC3T3共培养后,以CCK-8法检验eLTPS以及各对照组对鼠颅顶成骨细胞MC3T3增殖能力的影响,通过碱性磷酸酶染色以及定量分析来检测eLTPS对成骨矿化功能的影响,以扫面电镜动态观察成骨细胞在eLTPS上的黏附情况。结果:各组eLTPS在前3天的释放量达20%左右,随后各组材料LOV的释放速率逐渐减缓。载3层静电纺丝载药膜片的eLTPS样本具有更平缓而稳定的释放曲线,直至测量第49天时LOV释放量仅为62.5%,仍具备37.5%左右剩余的储备载药量,LOV的有效释放时程可达到49天以上。eLTPS组和对照组MC3T3的总体生长情况良好,培养第1天时,由于LOV短暂爆发释放的影响,eLTPS组细胞存活率较对照组稍降低,但差异没有统计学意义。随着培养时间的延长,eLTPS组标本成骨细胞增殖水平逐渐升高。细胞毒性评级为1级,制备材料具有良好的生物相容性。碱性磷酸酶染色显示eLTPS组的碱性磷酸酶活性最高(P＜0.05),染色呈深蓝色。扫面电镜显示成骨细胞在与eLTPS在共培养1天时即开始出现聚集和表面黏附,细胞伸展性良好。随着培养时间延长,生长黏附的细胞逐渐增多,并长入材料孔隙内部,细胞周围可见分泌的基质形成。结论:eLTPS具有理想的长程有效控释LOV的能力。细胞毒性实验证明了eLTPS具有良好的生物相容性,碱性磷酸酶检测提示材料具有良好的促进成骨分化和矿化功能。扫面电镜证实了成骨细胞在eLTPS中的黏附生长的能力。体外细胞实验的结果初步验证了eLTPS作为载抗骨质疏松骨支架材料促进局部骨组织愈合的潜能。第三部分:eLTPS在骨质疏松性骨缺损模型中的体内成骨作用研究实验一:骨质疏松动物模型的建立和验证目的:构建不可逆的兔骨质疏松模型,并验证模型构建的有效性。方法:选择新西兰兔作为实验动物,通过双侧卵巢切除和小剂量激素注射联合应用(OVX+MPi法),构建不可逆的中型骨质疏松动物模型。通过Micro-CT检测模型和对照组兔股骨下段兴趣区域的骨参数变化,验证骨质疏松模型的构建情况。结果:所有动物模型都存活,无严重不良并发症。Micro-CT结果显示OVX+MPi组骨组织皮质变薄,骨小梁稀疏,结构更细,骨小梁之间的分离程度增大。实验组骨参数:Tn=0.67±0.06 1/mm(P＜0.001),Tb.Th=0.14±0.01 mm(P＜0.01),BV/TV%=13.89%±1.07%(P＜0.05),BMD=161.74±11.58 g/cc(P＜0.001)。OVX+MPi组的各组Micro-CT测得的各关键骨组织参数都低于作为对照的假手术组,差异均有统计学意义。参考既往文献,可以认为实验组骨质疏松新西兰兔模型构建成功。结论:我们通过OVX+MPi法制备了不可逆的骨质兔骨质疏松动物模型。以Micro-CT检测实验组和对照组骨组织标本的微观结构和定量分析参数,验证了该模型的成功构建。实验二:eLTPS在兔骨质疏松模型中的体内成骨作用研究目的:在制备的兔骨质疏松模型体内验证eLTPS对骨质疏松性骨缺损的成骨修复能力。方法:以前兔骨质疏松模型为实验对象,按所制备eLTPS材料的形状截骨制备股骨下段干骺端负重区域的的骨组织缺损,分别植入eLTPS组和对照组。术后4周和12周时将实验动物安乐死并取得股骨下段标本,肉眼观察研究各组标本的大体形态,以Micro-CT检测各组标本微观结构和兴趣区域的骨参数变化情况,以硬组织切片和甲苯胺蓝染色、HE染色观察各组标本的组织形态学特征。结果:术后所有实验动物均存活,无特殊不良并发症发生。肉眼观见eLTPS和对照组在12周时都获得骨性愈合。Micro-CT结果显示eLTPS组材料周围骨小梁数量更多,排列形态相对更好。eLTPS组标本的关键骨参数获得了一定程度的改善,优于对照组。组织形态学结果显示材料生长情况良好,周围未见明显的炎性组织反应。相对与对照组,eLTPS组材料周围新骨组织长入明显更多,周围骨小梁数量更多,结构和排列良好,材料内部也有更多的新骨组织长入替代原材料和血管生成。结论:在兔骨质疏松骨缺损动物模型中,eLTPS组和对照组获得了不同程度的骨修复愈合结果。eLTPS组获得了更好的骨组织微观结构和良好的骨参数改善。组织形态学结果进一步验证eLTPS组有更理想的局部新生骨长入能力。综上所述,可以认为eLTPS对骨质疏松缺损修复的具有促进作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580;R687

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