凝血酶敏感蛋白-1介导的牙龈卟啉单胞菌脂多糖促进慢性牙周炎的机制研究

发布时间：2018-03-26 02:46

  本文选题：牙周炎　切入点：凝血酶敏感蛋白-1　出处：《安徽医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:慢性牙周炎是常见的慢性非特异性细菌感染性疾病,是成人牙齿缺失的重要原因。以牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)等口腔微生物感染为始动因素,细菌—宿主之间的相互作用促进了牙周组织的炎症性变化。P.gingivalis细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是强烈的免疫激动剂,可以激活宿主的免疫反应,激活相关信号通路。单核巨噬细胞在吞噬病原体起到防御作用的同时,释放大量炎症介质、细胞因子,如白细胞介素(Interleukins,ILs)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-ɑ,可以直接引起持续的免疫反应,造成组织继发性的损伤;还可以作为信使因子,将信息传递给其他细胞,调节细胞生长、分化与炎性介质的分泌等。牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblasts,h PDLFs)是牙周膜中数目最多,功能最重要的细胞。h PDLFs不仅是一种机械屏障,同时也具有免疫调节作用,可以合成细胞外基质中各型胶原纤维和蛋白多糖,在不同的微环境诱导下,也能表达多种蛋白酶、溶解素,导致牙周组织中基质成分分解和胶原纤维降解。作为具有成骨能力的细胞群体,h PDLFs还可调控核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)及其饵受体骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)的表达,是牙周组织改建、再生和修复的基础。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)来自于血小板反应蛋白家族,由Baenziger等1971年从凝血酶激活的血小板ɑ颗粒中分离。继而发现在多组织器官和多类别的细胞中都有表达。TSP-1是最早发现的血管生成抑制剂之一,也是TGF-β的经典活化剂。近年来的研究发现,TSP-1在感染和炎症免疫性疾病中也发挥重要的作用。TSP-1可以通过直接结合革兰阳性菌或者介导细菌与血小板的结合提高致病性,通过激活宿主免疫反应提升致炎因子的释放,同时降低对病菌的吞噬来造成致病菌长期定植,造成迁延不愈的炎症性损伤。2014年,Gokyu首次在牙周炎局部牙龈组织中检测到TSP-1的高表达,但是其具体的致病机制尚不明确。目的:鉴于TSP-1在其他炎症疾病中的功能,本研究旨在探讨TSP-1在促进慢性牙周炎发病进程中作用,特别是对于巨噬细胞和h PDLFs生长和炎症相关细胞因子的调节作用,以阐明慢性牙周炎的分子机制,为临床防治提供新思路和新策略。方法:收集慢性牙周炎和正常牙周的牙龈组织,采用HE染色、免疫组织化学、免疫荧光染色的方法,检测TSP-1的表达以及主要的细胞来源。以人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞和原代培养的h PDLFs为对象——开展体外研究。采用P.gingivalis LPS作为刺激细胞的活化剂,利用脂质体介导瞬时转染TSP-1 si RNA和p TT3-TSP-1过表达质粒,检测THP-1巨噬细胞TSP-1,IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的表达,细胞凋亡和周期的改变,以及NF-кB信号通路中p65和IκBα蛋白的改变;并在此基础上,利用巨噬细胞与h PDLFs共培养的模型,观察P.gingivalis LPS活化并过表达TSP-1的THP-1巨噬细胞对正常的h PDLFs的影响,检测h PDLFs细胞凋亡和周期的改变,以及基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)的表达。此外,瞬时转染TSP-1si RNA和p TT3-TSP-1过表达质粒至h PDLFs,探讨TSP-1对h PDLFs的直接作用。检测h PDLFs细胞活力、凋亡、周期及相关蛋白PCNA和caspase-1的表达;胶原破坏相关蛋白(MMP-2,MMP-9,TIMP-1)的表达;破骨相关因子(RANKL、OPG)的表达;和MAPK信号通路中p38MAPK,ERK1/2,JNK蛋白的改变。结果:(1)慢性牙周炎的牙龈组织中TSP-1的表达高于正常对照组,且可与CD68和vimentin共定位,表明CD68+巨噬细胞和vimentin+牙周膜成纤维细胞是TSP-1的重要来源。(2)组织块法可以分离培养波蛋白阳性、角蛋白阴性的人原代牙周膜成纤维细胞。(3)P.gingivalis LPS能够活化THP-1细胞,在一定范围内随着P.gingivalis LPS的浓度和作用时间的增加,TSP-1,IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的表达均有所增加。TSP-1可以调节巨噬细胞的生长和炎性介质的分泌:瞬时转染TSP-1 si RNA,在抑制TSP-1表达的同时,能够抑制IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的m RNA和蛋白表达,促进P.gingivalis LPS引起的THP-1细胞的凋亡;抑制了P.gingivalis LPS引起的NF-κB信号通路中p65和IκBα蛋白磷酸化水平。THP-1细胞转染p TT3-TSP-1之后,取得了相反的效果:IL-6,IL-1β和TNF-ɑ表达上调,P.gingivalis LPS引起的细胞凋亡受到抑制,进一步活化NF-κB通路,促进了p65和IκBα磷酸化蛋白的表达。NF-κB通路特异性阻滞剂PDTC可以阻断TSP-1对NF-κB的活化作用,继而拮抗TSP-1对P.gingivalis LPS活化的THP-1细胞分泌炎性因子的促进作用。(4)P.gingivalis LPS活化的THP-1细胞能对正常h PDLFs产生一定的损伤,转染p TT3-TSP-1,进一步促进h PDLFs细胞的凋亡,改变细胞周期的(S+G2)/M相,增加MMP-2,MMP-9的表达。(5)P.gingivalis LPS能够活化h PDLFs,P.gingivalis LPS在一定程度上,呈时间和剂量依赖性促进TSP-1,MMP-2,MMP-9的表达。TSP-1能够直接调节h PDLFs的生长和细胞因子的分泌。转染TSP-1 si RNA后,MMP-2和MMP-9的表达下降,TIMP-1的表达升高,破骨相关因子RANKL/OPG的比值下降,细胞活力增加,凋亡减少,以及相关蛋白PCNA增加,Caspase-1(p20)减少;MAPK信号通路中p38,ERK1/2和JNK磷酸化蛋白减少。转染过表达TSP-1质粒之后,结果相反:促进MMP-2,MMP-9的表达,TIMP-1的表达下降;RANKL/OPG的比值升高;细胞活力降低,凋亡增加;PCNA的下调,Caspase-1(p20)增加;p38,ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平升高。结论:本研究结果显示,慢性牙周炎炎症组织中高表达的TSP-1,可以作为重要的炎症介质,调节炎症局部巨噬细胞与牙周膜成纤维细胞的生长和炎性因子的分泌,从而参与慢性牙周炎的发病进程,此研究发现可以更好的深入理解慢性牙周炎的发病机制,从而为牙周炎防治策略以及临床靶向治疗提供线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

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本文编号：1665989