头颈肿瘤中HPV-16长调控区的甲基化状态及其对肿瘤的影响

发布时间：2018-04-02 10:39

  本文选题：人乳头瘤病毒　切入点：长调控区　出处：《南方医科大学》2015年博士论文

【摘要】：头颈部恶性肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNS CC)是常见的恶性肿瘤,主要包括口咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)已被证实具有致癌性,持续感染高危型HPV-16/18是除过度吸烟和饮酒外的另一个被确认的头颈鳞癌发病的独立危险因素。头颈鳞癌中约20%-30%的患者发病与感染HPV相关,世界范围内约70%的口咽鳞癌内检测到HPV感染。流行病学发现无烟酒嗜好的头颈鳞癌患者,尤其是年轻患者较前增多,HPV感染与部分头颈鳞癌的关系已越来越被重视。近年国外较多的流行病学研究报道了HPV在头颈肿瘤中的感染率,其因地区、种族、生活习惯等而有差别,而不同的检测方法,标本收集时间也可导致HPV感染率出现较大的差别。研究一个地区内头颈肿瘤中的HPV感染率有利于该地区的肿瘤的防治；此外,准确地筛选出HPV阳性头颈肿瘤标本,也是后续研究HPV相关头颈肿瘤的致癌机制、分子标记物等的必需过程。本课题中,我们采用高敏感度PCR扩增的方法,使用新鲜冰冻标本,检测HPV在头颈病变中的感染率,并进一步分析HPV阳性头颈部病变患者的临床特征。喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,其中鳞状细胞癌占96%-98%。世界范围内,喉癌患者中HPV的感染率波动很大,处于3%-60%之间。现有研究提示中国喉癌患者中可能有较高的HPV感染率,中国喉癌患者与HPV感染的相关性可能更加紧密；例如,近期一篇荟萃分析报道世界范围内高危型HPV的感染率为26.6%,其中纳入了3篇来自中国人群的研究文献,其感染率分别是58.8%,36.4%和41.67%,均高于欧美的平均感染率。但是,现有的关于中国喉癌中HPV感染率的研究报道明显少于欧美国家以及日本,并且各项研究在样本量、标本保存方法、检测手段、HPV分型等方面并不统一,所报道的HPV感染率也差别较大。此外,尽管有些研究发现喉癌中HPV感染率较高,但HPV感染与喉癌发病的相关性尚存在争议。为了评估中国喉癌患者整体中的HPV感染率,并进一步评价HPV感染与喉癌发生的相关性,本课题进行了中国喉癌患者中HPV感染率的荟萃分析,并进一步分析探讨HPV感染与喉癌的相关性。HPV-16基因包含编码早期蛋白(E1,E2,E4,E5,E6,E7),晚期蛋白(L1,L2)和一个非编码调控区基因。其中,长调控区(long control region, LCR)是HPV维持病毒复制周期的重要的调控结构,其序列包含病毒转录的增强子,促进子和复制起点,以及包含E2结合位点(E2 binding site, E2BS)在内的多种调节元件的结合位点。E6和E7是HPV-16主要的癌基因,E6和E7蛋白可以分别与肿瘤抑癌蛋白p53和pRb结合,并使其降解而发挥致癌作用以及维持肿瘤细胞的恶性转化。E2是HPV病毒重要的调节基因,E2蛋白可以通过与位于LCR区的4个E2BS位点(E2BS-1, E2BS-2, E2BS-3, E2BS-4)结合,从而发挥调节病毒复制的作用,并且可以抑制E6和E7癌蛋白的过度表达。DNA甲基化修饰(DNA methylation modification)是表观遗传学修饰(epigenetic)的一种重要表现形式,亦是在转录水平调控基因表达的一种重要方式。抑癌基因启动子的CpG位点的甲基化是导致抑癌基因转录失活的重要原因之一,与肿瘤的发生、发展密切相关。新近有研究发现,与HPV阴性肿瘤细胞相比,HPV阳性肿瘤细胞的基因的整体甲基化水平更高；HPV-DNA进入宿主细胞后也往往发生甲基化,宫颈癌中HPV-16 LCR的甲基化水平与宫颈肿瘤的严重性密切相关,说明HPV-DNA的甲基化与肿瘤的病变进展密切相关。由于LCR是HPV病毒中重要的调控结构,LCR区E2BS内的CpG位点的高甲基化可以影响E2蛋白结合到E2BS,从而影响发挥对癌基因E6和E7的表达抑制。所以,LCR区的甲基化与HPV阳性肿瘤的发生、进展、预后都密切相关。头颈部鳞癌与宫颈癌二者在发生发展、肿瘤的生物学特性、治疗及预后等各方面均有较大差别。然而,即使是在宫颈癌中,关于HPV-16 LCR区甲基化状态的研究亦有较多不一致的结果。在现有研究中,头颈鳞癌中HPV-16 LCR的甲基化状态的研究结果相当有限。在头颈鳞癌中,CPSCC (oropharygeal squamous cell carcinoma, OPSCC)与HPV感染的关系最为密切。检测HPV-16阳性的OPSCC标本中LCR区CpG位点的甲基化状态,尤其是LCR区E2BS位点的甲基化状态,有助于研究HPV基因的甲基化在癌变过程中的作用,检测LCR内的CpG位点的甲基化分布特征,可以进一步分析其与肿瘤的临床特征的关系。此外,迄今为止,尚无研究报道HPV阳性头颈鳞癌细胞中LCR内的CpG位点的甲基化状态,而检测不同HPV-16阳性肿瘤细胞中的LCR区甲基化状态,有利于建立各种研究HPV基因甲基化的实验模型,并进一步探讨病毒基因甲基化状态的对肿瘤的影响以及治疗等。癌基因E6和E7的转录主要受E2蛋白调节控制,E2蛋白通过与位于Promoter区内的E2BS-3和E2BS-4结合而发挥作用；此外,NF-1, AP1, Tef等多种调控原件也通过与位于Enhancer区内的受体结合参与到调节E6和E7转录的调节中。甲基化的CpG (meCpG)位点往往导致基因功能上的改变,由于CpG位点的甲基化是一个可逆的过程,所以通过去甲基化试剂逆转HPV阳性肿瘤细胞的LCR区内的meCpG位点的高甲基化状态,可以恢复LCR的调节功能,这不仅有助于研究LCR区的甲基化在维持肿瘤细胞的生长增殖等肿瘤特性中的作用,并有可能成为HPV阳性头颈肿瘤一个有效的治疗措施。CaSki, SiHa细胞株是最常用的HPV-16阳性宫颈癌细胞株,近年来,有学者尝试使用去甲基化试剂逆转上述细胞中HPV-LCR内meCpG位点的甲基化,从而研究甲基化状态对肿瘤细胞的影响,然而不同的细胞株之间,甚至使用相同细胞株的不同研究的实验结果并不完全一致。现有研究提示,逆转LCR区内的meCpG位点,不同的HPV阳性宫颈癌细胞,在生长、形态特性以及癌基因E6,E7的表达上可能不同,这可能与LCR区的甲基化状态有关。然而,HPV阳性头颈鳞癌细胞株较难建立,并且现有的绝大多数HPV阳性细胞株仍未商业化,至今尚无研究报道HPV阳性头颈鳞癌细胞的LCR区的甲基化状态以及细胞对去甲基化试剂的反应。本课题使用HPV-16阳性口咽鳞癌细胞株UM-SCC47,在给予去甲基化试剂处理逆转meCpG位点的甲基化状态后,研究UM-SCC47细胞的生物学特征以及癌基因E6和E7的变化,来探讨HPV-16LCR甲基化状态对HPV阳性头颈肿瘤细胞的影响,并通过比较HPV阳性细胞不同的甲基化状态对去甲基化处理的不同反应,探讨HPV基因的甲基化的致癌机理。此外,本研究还探讨逆转LCR区meCpG甲基化作为HPV阳性细胞的治疗措施的可行性。第一章头颈肿瘤中HPV感染的流行病学分析第1部分头颈部病变中HPV的检测及临床特征分析研究目的：检测头颈部病变组织中的HPV-DNA,分析HPV在头颈部病变中的感染情况,并分析HPV阳性头颈肿瘤的临床特性。研究方法：收集自2013年7月至2014年4月于日本琉球大学耳鼻喉科门诊或病房治疗的头颈部病变患者的组织标本,共180例,包括头颈肿瘤163例,非肿瘤良性病变包括炎症以及非典型增生等14例,喉乳头状瘤3例。头颈肿瘤标本中包括头颈鳞癌83例,咽喉部腺瘤5例,头颈部淋巴瘤16例,原发不明癌7例,腮腺肿瘤29例,颌下腺肿瘤4例,外耳肿瘤8例。所有标本活检离体后立即储存于液氮中。提取上述组织标本的DNA,并评估DNA质量。使用两对HPV共通型引物GP5+/GP6+和MY09/MY11进行巢式PCR扩增检测HPV-DNA,分别选用HPV-16阳性细胞CaSki和HPV阴性细胞HN041的DNA作为阳性对照和阴性对照。所有PCR阳性的扩增产物均需测序确定为HPV序列,并且与现有HPV亚型的序列比对,确定HPV亚型。结果：喉乳头瘤组织中HPV感染率最高,达到100%(3/3),均为低危型HPV-6感染。头颈鳞癌标本中,HPV平均感染率为22.9%(19/64),且均为高危型HPV-16感染,其中口咽癌患者感染率最高,达到36.0%(9/25),下咽癌的感染率为21.7%(5/23),鼻咽癌的感染率为20.0%(1/5),口腔癌的感染为17.4%(4/23),但是7例喉鳞癌组织中均未检测到HPV感染。此外,咽喉部腺癌(5例)、咽喉部良性病变(14例)、头颈部淋巴瘤(16例)组织中均各有1例检测到HPV-16 DNA；而甲状腺肿瘤(11例),腮腺肿瘤(29例),颌下腺肿瘤(4例),外耳道肿瘤(8例)以及原发不明癌(7例)组织中均未检测到HPV感染。经分析,HPV阳性头颈鳞癌患者的T分期较早,有统计学意义(P=0.034)；HPV阳性头颈鳞癌患者中低年龄段患者(≤55岁)比例高于HPV阴性头颈鳞癌患者,差异处于有统计学意义的临界值(P=0.074)。结论：喉乳头状瘤与HPV-6感染有明确相关性；部分头颈鳞癌与HPV感染相关,其中口咽癌最为密切,而喉癌与HPV感染关系尚不能确定；腮腺和甲状腺肿瘤与HPV感染无明显相关。第2部分中国喉癌中HPV感染率及HPV感染与喉癌相关性的荟萃分析研究目的：研究中国喉癌患者群体的高危型HPV-16/18感染率,并评估HPV-16/18感染与喉癌发病的相关性。研究方法：检索各种常用中英文数据库,按照预先制定的方案筛选相关文献,共纳入22篇符合纳入标准的文献。根据研究开始前制定的方案提取相关数据。使用R3.0软件进行荟萃分析,分析喉癌患者中HPV-16/18的阳性率。进一步筛选病例-对照研究,共12篇文献符合纳入标准,提取相关数据,进行荟萃分析评估HPV-16/18感染与喉癌发病的相关性。结果：喉癌患者中HPV-16/18阳性率的荟萃分析中,共提取到1477例喉癌病例,感染率为30.1%(95%CI：24.2%-36.8%)。评估高危型HPV-16/18感染的风险效应的荟萃分析中,一共提取到1040例喉癌病例和735例对照病例,喉癌组及对照组感染率分别为31.1%和5.0%,OR为8.07(95%CI：5.67-11.48),有统计学差异(P0.001)。结论：中国喉癌患者群体中有较高的HPV-16/18感染率；HPV-16/18的感染明显增加了中国人群中喉癌的发病风险。第二章HPV-16阳性肿瘤细胞和口咽鳞癌中HPV-16长调控区的甲基化状态分析研究目的:检测HPV-16阳性肿瘤细胞株UM-SCC47,CaSki,SiHa细胞中HPV-16长调控区(LCR)的甲基化类型；检测与HPV感染关系最为密切的口咽鳞癌(OPSCC)组织标本中HPV-16 LCR内的CpG位点的甲基化状态。研究方法：提取HPV-16阳性肿瘤细胞UM-SCC47, CaSki, SiHa细胞的DNA,提取本课题第一章检测以及本实验室前期检测的HPV-16阳性OPSCC组织标本的DNA,共19例。所有标本均经测序证实为HPV-16感染,且无其他型别HPV重叠感染。所有口咽鳞癌标本均来源于扁桃体,舌根,大多数病例处于临床晚期,其中Ⅰ期0例,Ⅱ期1例,Ⅲ期1例,ⅣA期17例,ⅣC期1例；标本进行组织学分化分类,其中低分化6例,中分化10例,高分化3例。对纳入研究的DNA进行亚硫酸氢盐修饰(Bisulfite modification)。然后,LCR分为5'-LCR区,Enhancer区和Promoter区3个片段,分别使用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite-sequencing PCR, BSP)特异性引物对进行扩增,纯化BSP产物,然后进行TA克隆,将细菌接种到培养板上培养,挑取至少6个或8个单克隆菌斑(细胞：8个克隆,组织标本：6个克隆),培养后提取质粒DNA分别进行测序,每个BSP片段产物克隆后均测序6次或8次(细胞：8次,组织标本：6次)。分析测序序列,获得甲基化的CpG (methylated CpG, meCpG)克隆出现的频率,计算每个CpG位点和LCR总体上的甲基化率。结果：①分析测序序列,显示亚硫酸氢盐修饰彻底,通过测序可以获得每个CpG位点的甲基化情况。CaSki细胞、SiHa细胞和OPSCC标本的LCR区均有15个CpG位点,而UM-SCC47细胞的LCR区由于在nt7435和nt31处发生碱基变异,影响了该处CpG位点的存在,所以目标区域内共有13个CpG位点。②UM-SCC47和CaSki细胞的HPV-16 LCR均为高甲基化状态,整体甲基化率分别为79.8%(83/104)和90.0%(108/120),SiHa细胞则为完全非甲基化(0/120)。19例OPSCC标本的LCR区内CpG位点的平均甲基化率为13.1%(194/1481),总体上LCR区的甲基化可分为3种类型：高甲基化型(甲基化率≥30%),低甲基化型(5%-30%)和非甲基化型(甲基化率5%)。③在UM-SCC47细胞和CaSki细胞中5'-LCR的CpG位点的甲基化率均高于Enhancer-Promoter区的甲基化率,分别为(91.7% vs.76.3%)和(100% vs.86.4%),由于进行测序的克隆数量的限制,差异均未达到显著统计学差异(P=0.147,P=0.063)。OPSCC标本中5'-LCR和Promoter区的甲基化率分别为14.6%(58/396)和16.5% (95/577),均高于Enhancer区的甲基化率8.1% (41/508),具有统计学差异(P=0.002,P0.001)。④M-SCC47细胞、CaSki细胞和OPSCC标本中,位于nt7862的CpG位点均呈现显著的低甲基化状态。在UM-SCC47和CaSki细胞内,除外位于E2BS-2内的CpG位点(nt7862),位于其他E2BSs内的CpG位点与位于E2BSs外的CpG位点相比均具有较高的甲基化率,分别为(97.9% vs.68.8%)和(100% vs.91.1%),均具有统计学意义(P0.001,P=0.060),在OPSCC标本中也有类似的结果(17.5% vs.11.2%),有统计学意义(P=0.001)。结论：HPV-16阳性肿瘤细胞中,在LCR区有两种以上的甲基化类型；OPSCC组织标本中,LCR区的平均甲基化率较低,但整体上仍存在明显不同的甲基化类型。第三章HPV-16 LCR内meCpG位点的去甲基化对HPV阳性头颈肿瘤细胞的影响研究目的：研究去甲基化药物处理HPV-16阳性口咽鳞癌UM-SCC47细胞后,细胞的生物学特征以及癌基因E6和E7的变化；分析不同HPV-16阳性肿瘤细胞对逆转LCR区meCpG甲基化的不同生物学特性变化,探讨不同HPV-16阳性肿瘤细胞中可能不同的致癌机制,以及去甲基化作为HPV阳性细胞的治疗手段的可行性。研究方法：①采用BSP和甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)两步扩增法来评估HPV-16 LCR区的总体甲基化状态；采用BSP法测定给予5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dc)处理后,3种HPV-16阳性肿瘤细胞LCR区CpG位点的甲基化状态变化；②提取细胞的总RNA,逆转录成cDNA；分别采用RT-PCR和实时荧光定量法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)扩增GAPDH (或β-actin), E6和E7,分析HPV-16 E6 和 E7 mRNA的表达。qRT-PCR采用标准曲线相对定量法,不同标本间的E6和E7的相对表达量采用E6/β-actin和E7/β-act in进行比较；③采用细胞免疫组化检测HPV-16阳性细胞E6和E7的蛋白表达;④测定5-aza-dc对细胞生长的影响,采用MTS四唑化合物和台盼蓝溶液测定细胞增殖抑制情况；⑤用Annexin-V/7-AAD对细胞进行染色,根据染色情况得出细胞凋亡率；用碘化丙啶(PI)对细胞进行染色,检测细胞周期阻滞；⑥采用Lipofectamine RNAiMax转染siRNA沉默细胞的E6和E7表达,然后再测定细胞生物学特性的变化,包括细胞增殖抑制,细胞凋亡,细胞周期变化。结果：①采用MSP两步扩增法和BSP扩增后TA克隆测序所得的LCR区去甲基化的结果一致,即0.5μM 5-aza-dc处理细胞96小时的去甲基化效果最好。②0.5μM 5-aza-dc处理UM-SCC47和CaSki细胞96小时后,LCR区内meCpG位点的甲基率分别降至19.2%(20/104)和29.2%(35/120),差异有统计学意义(P0.001,P0.001)；而SiHa细胞的CpG位点仍保持完全非甲基化状态(0%,0/120)。③5-aza-d c去甲基化处理明显降低了UM-SCC47细胞和CaSki细胞E6和E7 mRNA表达,UM-SCC47细胞的变化(P=0.034,P=0.008)和CaSki细胞的变化(P=0.017,P=0.023)均具有统计学意义,但是SiHa细胞无明显改变。采用细胞免疫组化测定UM-SCC47细胞和CaSki细胞内E6和E7蛋白表达及分布情况,结果与DMSO处理组相比,E6和E7染色强度以及范围明显减少。④5-aza-dc处理可以明显影响细胞的生长,抑制细胞增殖。UM-SCC47细胞和CaSki细胞的凋亡细胞均增多,有统计学意义(P=0.026,P=0.001),阻滞在S期的细胞增多,有统计学意义(P=0.048,P=0.003),阻滞在G2/M期的细胞增多,有统计学意义(P=0.002,P=0.044)。而5-aza-dc处理SiHa细胞后,细胞生长也受抑制,细胞凋亡、细胞周期阻滞的变化无统计学差异。⑤为验证去甲基化后细胞的生物学变化是否与E6和E7的表达下降相关,转染siRNA沉默UM-SCC47、CaSki和SiHa细胞的E6和E7表达后,均导致3种细胞均出现生长抑制,有统计学意义(P=0.044,P=0.006,P=0.022),诱导细胞凋亡增多,有统计学意义(P=0.026,P=0.036,P=0.016),导致阻滞于G2/M期的细胞增多,有统计学意义(P=0.027,P=0.035,P=0.012)。说明LCR的去甲基化而引起的细胞生物学特性变化与E6和E7的表达下降有关。此外,5-aza-dc还可以导致UM-SCC47, CaSki细胞的S期阻滞以及SiHa细胞的生长抑制,考虑与药物的S-期阻滞特性以及细胞毒性有关。结论：LCR区甲基化状态不同的2种HPV-16阳性肿瘤细胞对去甲基化处理表现出完全不同的反应,提示在HPV-16阳性肿瘤中,可能存在与LCR区甲基化状态相关的不同的肿瘤特性及致癌机制。此外,逆转LCR区内的meCpG位点甲基化状态,有可能作为治疗部分HPV阳性肿瘤患者的一种新疗法。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.91
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本文编号：1699999