脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用

发布时间：2016-10-31 09:14

  本文关键词：脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用，，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业科学院》 2015年

脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用

于会彬  

【摘要】：猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主范围广,可以感染啮齿类动物、猪、大象和非灵长类动物等。有报道称人也可以被感染。EMCV是一个无囊膜的单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,心病毒属。EMCV基因组全长约7.8 kb,含一个开放阅读框(open reading fragment,ORF),ORF的两边为5'和3'UTR(非翻译区)。5'UTR含有一个介导病毒多聚蛋白起始合成的内部核糖体介入位点(internal ribosome entry site,IRES)和一个poly(C)结构;3'UTR末端含有一个poly(A)尾巴。病毒的基因组编码一个多聚蛋白前体,在3C蛋白酶的参与下裂解为P1,P2,和P3,但是首次裂解发生在蛋白的复制的延伸过程,早于3C蛋白酶的形成,裂解点位于2A和2B蛋白之间,由NPG(P)基序介导。本研究旨在利用反向遗传操作技术建立EMCV-HB10株的c DNA感染性克隆。采用RT-PCR方法,一次性扩增出EMCV-HB10株全长基因组(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆到低拷贝载体p OK12中,构建含有全长EMCV HB10基因组的重组质粒(p EMCV-C9)。该重组质粒经酶切线性化,体外转录为RNA。将转录产物转染BHK-21细胞中进行拯救病毒。转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变(cell pathogenic effect,CPE)。拯救病命名为r EMCV-C9并经RT-PCR扩增并全基因组测序鉴定。5'UTR序列比对显示,拯救病毒含有9 bp的poly(C),而亲本病毒的poly(C)结构为C7TCTC3TC10,长度为24 bp。该差别可以作为区别亲本病毒EMCV-HB10和拯救病毒r EMCV-C9的一个基因标志。除poly(C)的长度外其余序列均与亲本病毒一致。间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和生长曲线试验结果显示,poly(C)长度减少不影响病毒的拯救,拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。动物感染试验结果显示,r EMCV-C9的LD50是2×104 TCID50,为亲本病毒EMCV-HB10的213倍,以上结果证明poly(C)的长度对病毒在BHK-21细胞上的生物学特性没有显著影响,但是缩短poly(C)降低了病毒对小鼠的致病力。重组拯救病毒r EMCV-C9得到了部分致弱。已有的研究表明,致弱的门戈病毒(Mengo virus)可以作为潜在的活病毒载体表达异源抗原。缩短poly(C)的EMCV感染性克隆平台的建立为研究新型基因工程疫苗提供了有力的工具。EMCV-HB10在BHK-21细胞上连续190次传代和蚀斑克隆(plaque clone assay),我们成功获得了一株克隆毒株,命名为EMCV-P190-C25。全病毒基因组测序表明,相对于亲本病毒EMCV-HB10,EMCV-P190-C25的2A蛋白缺失了127个氨基酸,还有一些氨基酸发生突变。随后我们将该病毒的部分基因克隆到p EMCV-C9骨架中,构建了一个重组病毒载体,命名为p C9-P190-?2A。在VP1和Δ2A的序列之间依次插入了一个起始裂解点,一个Flag标签和一个多克隆位点,并命名为p C9-P190-Flag-MCS-?2A。该重组质粒经Bam H I线性化后,体外转录的RNA对BHK-21具有感染性,获得的病毒命名为r C9-P190-Flag-MCS-?2A。动物试验结果表明,r C9-P190-Flag-MCS-?2A不引起小鼠死亡且无任何临床症状。为检测该病毒表达外源蛋白的能力,我们在p C9-P190-Flag-MCS-?2A的多克隆位点插入720 bp的e GFP基因并成功拯救出重组病毒,命名为r C9-P190-Flag-e GFP-?2A,该病毒在BHK-21细胞上连续传代,5代内仍然可以稳定表达e GFP外源蛋白,western blot检测表明,e GFP存在两种表达形式,一种为GFP单独表达,一种为e GFP-VP1融合表达。总结以上试验结果,我们成功构建了EMCV-HB10的全长感染性克隆平台,利用蚀斑克隆方法分离了一个2A蛋白缺失毒株,并在此基础上构建了一个无毒力的病毒载体,可以用于外源蛋白的表达和病毒感染的示踪。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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【参考文献】

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