【摘要】：目的:在当归[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]形成层分生组织(Cambial meristematic cells,CMCs)和愈伤组织细胞(dedifferentiated plant cells,DDCs)体系前期研究中,本课题组首次对两种细胞做了转录组测序,发现CMCs和DDCs中很多基因表达水平具有显著性差异,CMCs中合成桂皮酸、香草酸、咖啡酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸等次级代谢产物相关酶的基因表达量较DDCs显著提高,因此本实验对当归CMCs体系、DDCs体系和其根部中以上成分的含量进行测定。目前未发现利用植物CMCs对香豆素进行生物转化的相关报道,本实验首次尝试利用当归CMCs体系对6-羟基-3-羧酸乙酯香豆素(底物I)和7,8-二羟基-3-羧酸乙酯香豆素(底物II)进行生物转化。本课题组前期利用喜树(Camptotheca acuminate Decne.)CMCs和DDCs体系对4-甲基香豆素类进行生物转化,其中4,7-二甲基-6-羟基香豆素(b)转化为2个产物,前期已分离得到4,7-二甲基香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(b-1),本实验利用制备HPLC对另一个产物(b-2)进行分离、结构鉴定,以及测定单胺氧化酶(MAO)抑制活性。方法:利用HPLC测定当归CMCs体系、DDCs体系和其根部中的桂皮酸、香草酸、咖啡酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸含量。利用当归CMCs体系对6-羟基-3-羧酸乙酯香豆素(底物I)和7,8-二羟基-3-羧酸乙酯香豆素(底物II)进行生物转化,利用ODS柱色谱、制备HPLC等手段及重结晶技术对转化体系进行分离。利用制备HPLC对喜树CMCs和DDCs体系对4,7-二甲基-6-羟基香豆素(b)生物转化中产物(b-2)进行分离,并测定MAO抑制活性。结果与结论:当归CMCs中桂皮酸、咖啡酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸含量较DDCs高,分别是DDCs中的2.05、2.45、2.49和1.52倍,而当归DDCs中香草酸含量较高,是CMCs的1.67倍。综合来看,与当归DDCs体系相比,CMCs体系能产生更多的次级代谢产物,与转录组测序结果吻合。同时,当归CMCs中咖啡酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸含量均高于当归贮藏根,分别是贮藏根中的1.54、1.56和1.82倍,说明源自于当归贮藏根的CMCs体系,与原植物相比,能分泌出更多的次级代谢产物,更具有商业应用价值。通过当归CMCs体系对底物I的生物转化,对转化体系进行分离纯化,共得8个化合物,根据理化性质和光谱数据进行结构鉴定,分别为:p-hydroxyphenylethanol(I-1),4-hydroxy-3-methoxy benzene ethanol(I-2),daucosterol(I-3),Nb-acetyltrytamine(I-4),(3-methoxycar-bonylamino-2-methyl-phenyl)-cabamic acid methy lester(I-5),obtucarbamate A(I-6),1,1′-methanediyl bis(4-methoxybenzene)(I-7),β-sitosterol(I-8)。其中化合物I-3和I-8为当归植物化学成分,而化合物I-1、I-2、I-4、I-5、I-6和I-7未从当归原植物中分离得到过,可能是底物I作为外源物质诱导当归CMCs体系合成的化合物,本实验以当归中所含小分子化合物为基础推测了其生物合成途径。通过当归CMCs体系对底物II的生物转化,对转化体系分离纯化,共得8个化合物,分别为:1-(4-hydroxyphenyl)-1,2-ethanediol(II-1),5-methyluracil(II-2),p-hydroxyphenylethanol(II-3),daucosterol(II-4),phenazine-1-carboxamide(II-5),2-nonyl-4-hydroxyquinoline N-oxide(II-6),caffeine(II-7),β-sitosterol(II-8)。其中化合物II-1、II-4和II-8为当归化学成分;而化合物II-2、II-3、II-5、II-6和II-7未从当归原植物中分离得到过,可能是底物II作为外源物质诱导当归CMCs体系合成的化合物,本实验推测了其生物合成途径。其中phenazine-1-carboxamide为吩嗪类化合物,是首次从植物中分离得到,可见当归CMCs体系在底物II诱导下增加了天然吩嗪类化合物的来源。由以上结果可知,当归CMCs体系含有丰富的酶类,在底物I和底物II诱导下,合成了一系列化合物。然而在转化体系中未得到底物I和底物II的直接转化产物,推测二者可能作为外源化合物投入CMCs体系后,对细胞产生一定的毒性,CMCs体系开启自我保护机制,利用自身的酶将二者降解成对本体系无害的小分子化合物。本课题组前期以Pechmann法合成4个甲基取代的香豆素:4,8-二甲基-7-羟基香豆素(a)、4,7-二甲基-6-羟基香豆素(b)、4-甲基-6,7-二羟基香豆素(c)和4,7-二甲基-5-羟基香豆素(d),并利用喜树DDCs和CMCs体系对以上4个香豆素进行生物转化,已经分离纯化得到4个转化产物,分别为4,8-二甲基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(a-1)、4,7-二甲基香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(b-1)、4-甲基-6-羟基7-甲氧基香豆素(c-1)和4,7-二甲基香豆素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(d-1)。本实验利用制备HPLC对底物b的另一个转化产物进行分离并鉴定,得新化合物4,7-二甲基香豆素-6-O-β-D-甘露糖苷(b-2)。对以上9个化合物进行MAO抑制活性测定,发现底物a、b、c的MAO抑制活性均高于相应的转化产物a-1、b-1、b-2、c-1性,而底物d的MAO抑制活性低于相应的转化产物d-1。
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【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S567;Q946
【参考文献】
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2355111
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