菜粉蝶发育相关长非编码RNA的筛选与鉴定

发布时间：2019-02-25 14:31

【摘要】：菜粉蝶(Pieris rapae)属于鳞翅目、粉蝶科,是十字花科蔬菜重要的农业害虫,严重影响着农作物的产量。如Gilbert在其主编的《Insect Development》一书序言所述,昆虫发育的研究对于防治具有无可估量的价值,通过挖掘发育中的关键基因,既可直接采用RNA干扰等措施直接防治、亦可为害虫防控策略的探索提供重要参考。因此,从发育分子生物学视角挖掘菜粉蝶发育相关长非编码RNA,可为菜青虫防治提供更多的防治策略与手段。本论文以菜粉蝶为研究对象,首先对其进行了初步的基因组测序,在基因组测序过程中,采用300bp和500bp两种插入片段长度建库之后进行测序。测序总共产生了102.129G的碱基数,经过质控过滤之后总共剩余101.652 G的碱基数,抽取不同测序深度的数据采用Platanus软件进行denovo组装。基因组组装之后N50为5Kb,用于长非编码RNA的注释。其次,利用本实验室之前拼接好的菜粉蝶转录组进行lncRNA的筛选,首先将转录组序列比对到非冗余蛋白数据库、rRNA数据库、miRNA数据库及转运RNA(tRNA)数据库,除去同源的mRNA、rRNA、miRNA前体及tRNA序列,然后将剩余的序列用CPC软件进行序列长度和开放阅读框长度预测,除去长度小于200nt以及能编码100个氨基酸以上的序列,最后再用Portrait软件进行进一步编码可能性预测筛选,最终筛选出1194条可信度比较高的lncRNA。然后,对筛选出的lncRNA进行了基本的生物学特征分析,发现与mRNA的相比,lncRNA的长度相对较短,有较大一部分lncRNA的长度处于200到700bp,只有小部分lncRNA序列长度大于1Kb。lncRNA开放阅读框的长度也相对较短,大部分序列的开放阅读框长度低于100nt,只有小部分lncRNA序列长度大于100nt。接着,利用RSEM和edgeR软件统计了lncRNA在菜粉蝶不同的生长发育阶段的表达量并对差异表达基因进行了统计和分析。表达量分析可以看出,lncRNA在各个时期表达的lncRNA数目差不多,都约为300条左右。在菜粉蝶每个发育阶段特异表达的lncRNA数目差异比较大,在卵期特异表达数目最多,约为280条,在其余生长阶段特异表达的lncRNA数目较少,都约为60条左右。通过差异表达分析找出97条在菜粉蝶不同生长发育阶段差异表达的lncRNA,差异表达基因主要集中在卵期到一龄幼虫时期,且在卵期表达量较高。在卵期到一龄幼虫阶段,lncRNA的表达量明显下降,在其余生长发育阶段,lncRNA差异表达的数目较少。再次,将筛选出的菜粉蝶lncRNA和mRNA序列匹配到基因组序列上,获得lncRNA和mRNA在基因组上的位置信息。根据lncRNA在基因组上的位置关系将lncRNA进行了分类,总共找出了635条基因间lncRNA、212条基因内lncRNA、347条同义和反义lncRNA。同时,根据位置信息找出lncRNA临近的mRNA共2164条,然后对mRNA进行KEGG、GO注释和差异表达分析。为了研究菜粉蝶中lncRNA和miRNA的相互作用,用miRNA的target预测软件进行预测之后得到36条miRNA和lncRNA发生了相互作用。最后,随机选取9条具有差异表达的lncRNA序列,通过qPCR实验验证其表达量,实验结果显示9个lncRNA的表达趋势和利用RNA-seq及生物信息学方法计算出来的表达量一致,证明本次数据分析的准确性。本研究通过多种生物信息学分析方法获得菜粉蝶基因组序列和1194条lncRNA序列,并找出97条在菜粉蝶不同生长发育阶段差异表达的lncRNA。利用基因组序列找出了2164条lncRNA邻近的mRNA,并在其中发现1671条差异表达基因。通过miRNA预测软件预测出36条miRNA和lncRNA发生了相互作用。这些工作为今后研究菜粉蝶的lncRNA分子功能奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433.4

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本文编号：2430274