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水稻CCCH型锌指蛋白C3H12底物类型与活性部位初步研究

发布时间:2019-06-01 13:21
【摘要】:病害是造成水稻减产的主要原因之一,研究和发掘水稻自身抗病相关基因可为培育优良的抗性品种提供新的途径。CCCH型锌指蛋白广泛的存在于真核生物中,在植物的生长发育和对逆境的应答过程中扮演重要角色。虽然植物生理学研究已发现C3H12是水稻中首个参与抗病反应的CCCH型锌指蛋白,但仍缺少生化和结构等分子机理层面研究,对其结合底物类型、活性部位和与底物的结合模式并不了解。本研究首先构建了C3H12全长基因的原核表达载体,表达和初步纯化得到C3H12(WT)。其次,合成了生物素标记的可能与目标蛋白结合的RNA底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,利用RNA EMSA方法研究C3H12与底物相互作用。最后,对C3H12的氨基酸序列进行了结构分析,根据其串联锌指排列相对位置对基因进行了缺失突变,构建和表达缺失突变蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439,研究不同结构区域在底物结合中的作用。实验中取得的结果如下:(1)使用PCR和overlap PCR等方法对C3H12(WT)蛋白以及其截短突变蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439进行原核表达载体构建,获得载入目的片段且分别带有MBP标签和His标签的p MAL和p ET32原核表达载体,测序所得结果正确。(2)探索蛋白在天然培养基培养条件下的诱导条件和纯化方案,发现蛋白可以在30℃以下温度稳定表达,大肠杆菌可以获取天然培养基中的锌,不需要额外提供锌离子。MBP标签和His标签蛋白的纯化不能采用实时穿流过柱的常规亲和层析方法,蛋白需要与柱材做低温条件下两小时以上的孵育才能与柱材结合。亲和、离子交换、凝胶过滤以及疏水等层析等常规方法尽管可以将标签和目的条带分开,但不能除去杂蛋白,暗示杂蛋白与目的蛋白可能存在结合。采用0.3%浓度表面活性剂sarkosyl处理后,获得单一条带蛋白。(3)合成了可能与蛋白互作的RNA底物,标记并纯化底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,点印记试验表明获得生物素成功标记的底物。(4)运用RNA-EMSA方法研究C3H12与ARE19的互作,发现C3H12结合ARE19类型的底物。缺失突变蛋白的EMSA试验发现C3H12ΔC201-439不与底物结合,而C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439与底物结合。表明C3H12底物结合部位为突变蛋白C3H12ΔN1-329。C3H12Δ201-329与底物结合,表明长141氨基酸特殊间隔在底物结合上不起直接关键作用,暗示它的存在可能与其它蛋白互作有关。以上结果揭示C3H12的C端110个氨基酸片段参与ARE19类型底物结合,可进一步使用NMR手段解析该小分子量蛋白结构,为底物结合模式研究奠定基础,也给水稻自身抗病研究提供分子机制上的理论支持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S435.11


本文编号:2490305

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