β-氨基丁酸受体天冬氨酰-tRNA合成酶在马铃薯晚疫病诱导抗性中的功能研究
发布时间：2019-07-14 21:09
【摘要】：非蛋白质氨基酸β-氨基丁酸(DL-β-氨基丁酸,β-Aminobutyric acid,BABA)是一种广谱化学诱抗剂,可以诱导多种植物产生对多种病原菌和逆境胁迫的抗性,且对环境没有污染,但缺点是会对植物生长造成影响,并且成本较高。BABA诱导抗性(BABA-IR)的机理尚未揭示。最近研究报道在拟南芥中找到了BABA的受体,即天冬氨酰-tRNA合成酶(AtIBI1)。AtIBI1在结合了BABA后行使了非传统的功能——激发一系列的抗性反应。研究显示BABA抑制生长是通过另外一条途径,因此理论上超表达BABA的受体可以实现提高抗性的同时不抑制植物生长。本研究依据At IBI1的蛋白序列,在马铃薯中的克隆了BABA的受体StAspRS,获得超表达StAspRS的马铃薯转基因株系;观察了转基因株系表型,验证转基因株系基础抗性是否提高;最后通过酵母双杂筛选互作蛋白寻找StAspRS的互作蛋白,以揭示天冬氨酰-tRNA合成酶行使抗病功能的机理。主要结果如下:1.通过生物信息学分析找到马铃薯上可能编码天冬氨酰-tRNA合成酶的所有基因,通过与At IBI1比较分析,筛选并克隆了马铃薯中对应的BABA受体基因StAspRS。荧光定量PCR分析了StAspRS及其三个同源基因的表达模式,发现StAspRS在病原诱导下上调表达,BABA诱导下没有变化。2.得到5个超量表达StAspRS的转基因株系,表型观察发现,3个超表达株系生长受到抑制,2个超表达株系生长正常。3.挑选生长正常的转基因株系OE-5和OE-6进行一系列晚疫病抗性鉴定,通过病斑面积、菌丝生长量、PTI,SA,JA信号途径marker基因的表达分析,发现转基因株系晚疫病抗性有一定程度的提高,伴随基础抗性相关基因的上调表达。4.用StAspRS全长、StAspRS的N末端片段(StAspRS-N)、StAspRS的C末端片段(StAspRS-C)片段分别进行酵母文库筛选,结果表明StAspRS全长找不到互作蛋白,StAspRS-N可以筛到StAspRS本身C末端片段(第131氨基酸以后的片段),StAspRS-C可以筛到StAspRS本身全长。StAspRS-N和StAspRS-C还筛到了其他蛋白。点对点初步验证StAspRS-N和StAspRS-C可以互作,但与全长StAspRS不能互作。点对点验证显示,筛到的7个其他蛋白中只有vacuolar protein-sorting-associated protein 11 homolog与StAspRS-N互作。
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图片说明： 第三章 结果与分析3.1 生物信息学分析马铃薯中可能编码 StAspRS 的基因根据 Luna 等报道的拟南芥 β-氨基丁酸受体 AtIBI1（At4g31180）的蛋白序列，在 NCBI 中用 protein blast 进行比对，找到一个相似性高于 70%（380/541）的马铃薯 蛋 白 序 列 （ XP_006345989 ）， 编 码 593 个 氨 基 酸 。 进 一 步 在 PGSC（http://potato.plantbiology.msu.edu）数据库中搜索到 4 条编码 aspartyl-trna synthetase的序列，序列 ID 分别为：Sotub05g029450.1.1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116。4 个氨基酸序列与 XP_006345989和 AtIBI1 的 氨 基 酸 序 列 比 对 如 图 3.1 所 示 ， AtIBI1 ， XP_006345989 和Sotub05g029450.1.1 相似性很高。Sotub05g029450.1.1 与 XP_006345989 氨基酸比较显示，Sotub05g029450.1.1 的 N 端有 5 个氨基酸（XXSPS）插入，，其余部分完全相同。其余 4 个与 AtIBI1 相似性不高，仅有 30%左右。
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图片说明： http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/。Fig. 3.1 Alignment of five StAspRS protein sequences with AtIBI1.From top to bottom, the protein sequences are as follows: Sotub05g029450.1.1、XP_006345989、AtIBI1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116.Sotub05g029450.1.1、Sotub03g024600.1.1 are from https://solgenomics.net/; XP_006345989 is fromNCBI; PGSC0003DMP400038137、PGSC0003DMP400009116 are fromhttp://solanaceae.plantbiology.msu.edu/.根据 Luna 等的报道中，AtIBI1 在拟南芥中有一个同源基因 At4g26870，其编码氨基酸序列与 AtIBI1 有 84%的相似性，在病原菌 H.arabidopsidis 诱导下，AtIBI1 显著上调表达，而 At4g26870 的表达没有变化。进一步的研究表明，At4g26870 不是BABA 的受体。两者的蛋白序列，差异主要集中在 N 端 extension 区与 N 端反义密码子识别区，因此，可以推测 AtIBI1 的 N 端结构可能和非传统的抗病功能有很大关系。将 AtIBI1，At4g26870，Sotub05g029450.1.1 和 XP_006345989 氨基酸序列进行比对（图 3.2），可以看出它们之间的差异主要还是集中在 N 端 extension 区与 N 端反义密码子识别区。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.32
本文编号：2514523
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图片说明： 第三章 结果与分析3.1 生物信息学分析马铃薯中可能编码 StAspRS 的基因根据 Luna 等报道的拟南芥 β-氨基丁酸受体 AtIBI1（At4g31180）的蛋白序列，在 NCBI 中用 protein blast 进行比对，找到一个相似性高于 70%（380/541）的马铃薯 蛋 白 序 列 （ XP_006345989 ）， 编 码 593 个 氨 基 酸 。 进 一 步 在 PGSC（http://potato.plantbiology.msu.edu）数据库中搜索到 4 条编码 aspartyl-trna synthetase的序列，序列 ID 分别为：Sotub05g029450.1.1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116。4 个氨基酸序列与 XP_006345989和 AtIBI1 的 氨 基 酸 序 列 比 对 如 图 3.1 所 示 ， AtIBI1 ， XP_006345989 和Sotub05g029450.1.1 相似性很高。Sotub05g029450.1.1 与 XP_006345989 氨基酸比较显示，Sotub05g029450.1.1 的 N 端有 5 个氨基酸（XXSPS）插入，，其余部分完全相同。其余 4 个与 AtIBI1 相似性不高，仅有 30%左右。
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图片说明： http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/。Fig. 3.1 Alignment of five StAspRS protein sequences with AtIBI1.From top to bottom, the protein sequences are as follows: Sotub05g029450.1.1、XP_006345989、AtIBI1、PGSC0003DMP400038137、Sotub03g024600.1.1、PGSC0003DMP400009116.Sotub05g029450.1.1、Sotub03g024600.1.1 are from https://solgenomics.net/; XP_006345989 is fromNCBI; PGSC0003DMP400038137、PGSC0003DMP400009116 are fromhttp://solanaceae.plantbiology.msu.edu/.根据 Luna 等的报道中，AtIBI1 在拟南芥中有一个同源基因 At4g26870，其编码氨基酸序列与 AtIBI1 有 84%的相似性，在病原菌 H.arabidopsidis 诱导下，AtIBI1 显著上调表达，而 At4g26870 的表达没有变化。进一步的研究表明，At4g26870 不是BABA 的受体。两者的蛋白序列，差异主要集中在 N 端 extension 区与 N 端反义密码子识别区，因此，可以推测 AtIBI1 的 N 端结构可能和非传统的抗病功能有很大关系。将 AtIBI1，At4g26870，Sotub05g029450.1.1 和 XP_006345989 氨基酸序列进行比对（图 3.2），可以看出它们之间的差异主要还是集中在 N 端 extension 区与 N 端反义密码子识别区。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.32
【参考文献】
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本文编号：2514523
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