大白猪CXCL8的克隆表达及生物学活性研究
发布时间：2019-11-28 17:41
【摘要】：CXCL8是一种CXC趋化因子,可激活和趋化中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等。中性粒细胞可向感染处聚集并参与炎症反应,该反应受CXCL8的调节,迅速、强烈,是宿主防御的第一道防线。但是,炎症过程中过量的中性粒细胞浸润也会导致过度炎症反应,导致宿主组织细胞被破坏。在大部分猪病发生发展过程中,炎症是最主要的病理变化,而CXCL8在这些疾病过程中也起重要的作用。大白猪是我国养猪业重要的猪种之一,目前对大白猪CXCL8的研究报道比较少。本研究克隆了大白猪CXCL8基因,对CXCL8及CXCL8的突变体(G58P)进行可溶性表达,并验证了它们的生物学活性,为进一步研究猪CXCL8的功能与作用机制,开发抑制猪炎症的靶向性药物提供了基础。主要研究内容如下:1大白猪CXCL8及G58P的克隆与表达纯化提取大白猪肺组织m RNA,利用RT-PCR扩增CXCL8基因。测序正确后将该基因克隆至p GEX-6p-1载体上,获得重组质粒p GEX-PCXCL8。转化至大肠杆菌Rosetta中,经表达条件的优化,外源基因在上清中高效表达。通过蛋白纯化系统AKTA prime 10纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western Blot显示蛋白纯化效果较好。将CXCL8第58位甘氨酸(G)突变为脯氨酸(P),根据相应的碱基序列合成CXCL8突变体基因G58P,利用DNA重组技术将其克隆至p GEX-6p-1载体上,按照上述方法表达纯化G58P蛋白。2 CXCL8的体内活性验证将重组蛋白用生理盐水稀释到4mg/m L、400μg/m L、40μg/m L、4μg/m L,分别以25μL不同浓度的PCXCL8重组蛋白对BALB/c小鼠进行滴鼻,同时设置相同浓度的GST蛋白对照组及生理盐水空白对照组。12h后剖杀所有小鼠,取肺进行组织病理学观察,BALF中性粒细胞计数,肺组织MPO活力检测来评估重组蛋白的生物学活性。组织病理学观察发现不同浓度的PCXCL均可引起小鼠肺炎,4mg/m L GST组有轻微的炎症,其余浓度GST组与生理盐水对照组没有明显异常;PCXCL8实验组MPO活力均显著高于GST对照组及生理盐水组;4mg/m L PCXCL8滴鼻组BALF中性粒细胞数目远远高于GST组。3 G58P的体内活性验证实验组以4mg/m L浓度G58P 25μL剂量滴鼻处理BALB/c小鼠,同时设置PCXCL8阳性对照组,PCXCL8与G58P混合组,生理盐水对照组,不作处理的空白对照组。12h后剖杀所有小鼠,取肺脏。通过组织病理学观察,BALF中性粒细胞计数,肺组织MPO活力检测来评估G58P的生物学活性。组织病理学观察发现实验组、混合组、PCXCL8对照组均呈现肺炎特征,生理盐水对照组与空白对照组没有明显异常;实验组、混合组、PCXCL8对照组MPO活力无显著差异,但均显著高于生理盐水对照组和空白对照组;实验组、混合组、PCXCL8对照组BALF中性粒细胞数目无显著差异,但均显著高于生理盐水对照组和空白对照组。结论:利用原核表达载体p GEX-6p-1,可以对PCXCL8与G58P进行可溶性表达,所获得PCXCL8与G58P蛋白都具有良好的生物学活性;PCXCL8第58位氨基酸G-P突变不能对其生物学活性产生重要影响。
【图文】：
其中 72 个氨基酸的 CXCL8 生物学活性最强，即通常所指的成熟 CXCL8（MoWS etal，1989）。二级结构包括α螺旋和β片层，有肝素交联，无糖基，氨基末端和羧基末端均为丝氨酸，等电点为 pH8.0～8.5。X 线晶体衍射与核磁共振显示其三维结构为六个反向平行的α片层和两个对称且反向平行的β螺旋二聚体，如图 1。各种形式的 CXCL8 均对应有这 72 个氨基酸残基，在氨基酸的第 7、9、34 和 50 位上均存在 4 个保守的半胱氨酸残基。天然状态下，在第 7 和 34 位（Cys-7/Cys-34）、第9 和 50 位（Cys-9/Cys-50）之间形成链内二硫键（Baggiolini M et al，1992）。如果这些二硫键被还原，则 CXCL8 的活性消失。根据 4 个半胱氨酸残基中前两个残基排列顺序的不同，CXCL8 又可分为α、β两个亚家族，α亚家族因前两个半胱氨酸残基之间插入了一个其他氨基酸残基，故被称为 C-X-C 亚家族；β亚家族的前两个半胱氨酸残基彼此相邻，故又称为 C-C 亚家族（Baggiolini M et al，，1992；David R et a2008；Russo RC et al，2010）。有很多趋化因子都能和 CXCL8 的趋化因子受体CXCR1/CXCR2 结合，称作 CXCL8 家族趋化因子，它们有一个共同的 ELR+（谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）基序（Russo RC et al，2010；Bachelerie F et al，2013）。研究表明只有哺乳动物的 CXCL8 才带有 ELR+基序。
图 3 以 CXCR1 和 CXCR2 为中心介导器官特异性疾病。Fig.3 Central role of CXCR1 and CXCR2 mediating organ-specific pathologies.CXCL8 家族和 CXCR1/2 受体调节各种特异器官疾病，大多数有害影响与高度强烈的慢性免疫反应和组织损伤有关，也有一部与实质细胞激活有关（红色框）。然而，CXCR1/2 受体的激活也能带来一些积极的影响，例如维持组织稳态，通过 CXCL8 家族的多效作用平衡各种病理组织损伤（蓝色框）。CXCL8 family and CXCR1/CXCR2 receptors regulate various specific organs diseases, mos
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828
本文编号：2567105
【图文】：
其中 72 个氨基酸的 CXCL8 生物学活性最强，即通常所指的成熟 CXCL8（MoWS etal，1989）。二级结构包括α螺旋和β片层，有肝素交联，无糖基，氨基末端和羧基末端均为丝氨酸，等电点为 pH8.0～8.5。X 线晶体衍射与核磁共振显示其三维结构为六个反向平行的α片层和两个对称且反向平行的β螺旋二聚体，如图 1。各种形式的 CXCL8 均对应有这 72 个氨基酸残基，在氨基酸的第 7、9、34 和 50 位上均存在 4 个保守的半胱氨酸残基。天然状态下，在第 7 和 34 位（Cys-7/Cys-34）、第9 和 50 位（Cys-9/Cys-50）之间形成链内二硫键（Baggiolini M et al，1992）。如果这些二硫键被还原，则 CXCL8 的活性消失。根据 4 个半胱氨酸残基中前两个残基排列顺序的不同，CXCL8 又可分为α、β两个亚家族，α亚家族因前两个半胱氨酸残基之间插入了一个其他氨基酸残基，故被称为 C-X-C 亚家族；β亚家族的前两个半胱氨酸残基彼此相邻，故又称为 C-C 亚家族（Baggiolini M et al，，1992；David R et a2008；Russo RC et al，2010）。有很多趋化因子都能和 CXCL8 的趋化因子受体CXCR1/CXCR2 结合，称作 CXCL8 家族趋化因子，它们有一个共同的 ELR+（谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）基序（Russo RC et al，2010；Bachelerie F et al，2013）。研究表明只有哺乳动物的 CXCL8 才带有 ELR+基序。
图 3 以 CXCR1 和 CXCR2 为中心介导器官特异性疾病。Fig.3 Central role of CXCR1 and CXCR2 mediating organ-specific pathologies.CXCL8 家族和 CXCR1/2 受体调节各种特异器官疾病，大多数有害影响与高度强烈的慢性免疫反应和组织损伤有关，也有一部与实质细胞激活有关（红色框）。然而，CXCR1/2 受体的激活也能带来一些积极的影响，例如维持组织稳态，通过 CXCL8 家族的多效作用平衡各种病理组织损伤（蓝色框）。CXCL8 family and CXCR1/CXCR2 receptors regulate various specific organs diseases, mos
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828
【参考文献】
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本文编号：2567105
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