毛竹漆酶家族全基因组分析及PeLAC和PeLAC190的功能研究
发布时间：2020-02-08 17:40
【摘要】：竹子作为重要的森林资源在保障我国木材安全、生态安全等方面发挥着重要作用。漆酶(Laccase,LAC)是一种铜蓝氧化酶,参与木质素单体聚合以及非生物胁迫响应。本文以毛竹(Phyllostachysedulis)为实验材料,在对LAC家族基因进行了全基因组分析的基础上,重点对2个漆酶基因PeLAC和PeLAC190进行了研究,以期为竹子分子育种提供理论依据。主要研究结果如下:1.通过生物信息学分析发现,在毛竹基因组中共有LAC基因同源序列23条,其基因结构、理化性质存在着明显差异。构建系统进化树分析结果表明,这些基因分别属于5个亚家族,其内含子数量从1-7个不等,同一亚家族中的内含子个数也存在一定的差异。利用毛竹转录组数据分析各PeLACs基因在不同组织中的表达模式,结果表明不同PeLACs基因在毛竹根、茎、叶、鞭、20 cm、50 cm笋、早花期花序和晚花期花序中的表达量存在明显差异,表明它们在毛竹不同组织中可能发挥着不同的作用。2.采用同源克隆的方法,从毛竹中分离获得了2个LACs同源基因,分别命名为PeLAC和PeLAC190,它们的cDNA序列分别为1 692 bp和1 719 bp,对应的基因组序列为2785 bp和2391bp,二者均有6个外显子和5个内含子。psRNATarget分析发现PeLAC和PeLAC190中均存在miR397靶点。PeLAC和PeLAC190分别编码563个和572个氨基酸,均具有漆酶特有的3个铜离子保守结构域,以及漆酶活性中心必须的10个组氨酸残基及1个半胱氨酰残基。另外,还获得了毛竹Phe-miR397的88bp前体序列。3.利用RLM-5'RACE技术,验证了Phe-miR397对PeLAC和PeLAC190具有切割作用,切割位点均位于靶点的第10-11位碱基之间。在毛竹不同高度笋中,Phe-miR397的表达与PeLAC、PeLAC190呈相反趋势,进一步证明了Phe-miR397可在转录水平调控PeLAC和PeLAC190的表达。PeLAC和PeLAC190在毛竹中为组成型表达,且均在茎里表达丰度最高,根中次之。NaCl(400 mmol·L 1)和ABA(100μmol·L-1)诱导PeLAC和PeLAC190的表达,而受GA3(100μmol·L-1)的抑制;CuSO4(5 mmol·L-1)对PeLAC190的表达影响不明显,而抑制PeLAC,表明二者在激素信号转导及响应逆境胁迫中可能发挥着重要作用。4.分别构建Phe-miR397以及PeLAC和PeLAC190的过表达载体,采用浸花法转化模式植物拟南芥。结果表明,与野生型相比,PeLAC和PeLAC190转基因植株均出现植株变小,叶柄变长的现象,茎木质素含量增加;而Phe-miR397转植株根系生长快。干旱处理条件下,PeLAC和PeLAC190转基因植株抗旱性增强,Phe-miR397转基因植株抗旱性减弱。酚酸处理后PeLAC和PeLAC190转基因植株成活率高于野生型。由此表明,PhemiR397及其靶基因PeLAC、PeLAC190参与木质素合成及非生物胁迫响应。5.构建包含自身信号肽PeLAC的酵母表达载体,转化毕赤酵母菌株GS115,在含有0.3 mmol·L-1 CuSO4和0.2 mmol·L-1 ABTS的MM平板上划线培养,经甲醇诱导后呈现墨绿色,证明获得阳性克隆。阳性克隆经液体培养诱导,取上清进行SDS-PAGE检测,结果显示约在77 kDa有一条特异条带,与预期融合蛋白相符。体外酶活分析表明,经诱导48 h具有活性的PeLAC蛋白,活力最大为2.031 U·m L-1;酶促反应最适pH为4.0,温度40℃。由此表明,利用毕赤酵母表达PeLAC能够获得具有生物活性的酶蛋白。本研究为揭示毛竹漆酶基因在木质素合成及非生物胁迫中的功能提供了参考依据,也为进一步利用基因工程手段来调控植物木质素含量和抗逆育种提供了新的基因资源。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S795.7
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S795.7
【参考文献】
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本文编号：2577566
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