异源表达几种核糖体失活蛋白及对TMV的抑制作用研究

发布时间：2020-03-05 11:07

【摘要】：植物病毒病在世界范围内广泛存在,它是仅次于真菌病害的一大病害,严重危害重要的经济作物。随着基因工程的迅速发展,使得利用抗病育种这一技术防治植物病毒病得到更为广泛的应用。近年的研究表明,将核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)基因转化植物,转基因植物获得抗病毒能力。因此,本文克隆获得四种核糖体失活蛋白(无毒缺失突变体PAP-c、α-MC、MAP30、Luffin-a),将四种RIPs在本氏烟中异源表达,在烟草中观察四个蛋白在细胞中的定位情况。研究RIPs对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。为解释不同RIPs对植物病毒的抗性作用及对RIPs诱导植物产生抗性抵御病毒侵染的作用提供依据。根据GenBank中已报道的商陆抗病毒蛋白基因、丝瓜核糖体失活蛋白基因和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP-c和α-MC、MAP30、Luffin-a基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜、丝瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin-a和商陆PAP-c;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin a和商陆PAP-c融合在GFP的N端,构建融合绿色荧光蛋白的瞬时表达载体,亚细胞定位根据融合标记的GFP来确定,从而验证预测结果;在本氏烟中植物中通过根癌农杆菌介导的方法瞬时表达RIPs,再接种TMV,病毒在接种叶片的蛋白表达量和RNA积累量通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量RT-PCR两种方法检测,分析瞬时表达RIPs的抗病毒效果。利用实时荧光定量RT-PCR检测植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究RIPs的抗病毒机理。克隆得到基因α-MC、MAP30、Luffin-a和PAP-c,分别为861、861、831和711 bp。Wolf PSORT预测显示RIPs主要定位于细胞质膜上。用共聚焦荧光显微镜下观察发现,标记GFP的RIPs均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的RIPs定位结果相一致。异源表达四种RIPs的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达RIPs后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现四种RIPs处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6天后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6天后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;实时荧光定量PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍,表明四个RIPs对TMV复制和移动都有明显抑制;实时荧光定量PCR结果分析显示,NPR1基因在只注射TMV、单独分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a以及分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约1.5-3倍左右,在只分别接种α-MC、MAP30、Luffin-a和分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者约5-7倍,表明异源表达RIPs对植物病毒的抗性作用可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。异源表达RIPs显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达RIPs方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。
【图文】：

核糖体失活蛋白,类型

丝瓜毒蛋白、皂草素等[68]。该类型的蛋白只有一条多肽链组成，由于缺少结合的配体 B 链不能进入到细胞内，因此对细胞具有较小的毒性。型核糖体失活蛋白的数量相对较少，只在 8 种植物中有发现[67]。这类 RIPs异源二聚体蛋白，分子量约为 60 kDa，由 A 链和 B 链等两条链组成，A有 RNA N-糖苷酶活性的，B 链是一个对半乳糖专一的凝集素，其作用可核细胞表面的糖蛋白结合，从而使 A 链逆向进入到胞质溶胶，参与蛋白翻，从而阻止蛋白质的合成。此外，极少数的 RIPs 由 4 条多肽链组成，是一体由两个相同的双链 RIPs 结合在一起形成的。 III 类型的 RIPs 较为少见，目前为止，在玉米和大麦中被发现，也有学者类型是 I 型的变种。III 型 RIPs 是先通过合成无活性的前体，然后进行酶，在形成活性位点的所有氨基酸之间进行切割，如玉米中的 b-32 蛋白，通部切割加工后，产生两条大小分别为 16.5 KDa 和 8.5 KDa 的多肽链亚基，玉米中发现的两种 RIPs 都是属于 III 型。

核糖体失活蛋白,作用机理,核糖体

第一章文献综述，能够水解几乎所有生物来源的核糖体，导致核糖体失IPs 的 RNAN-糖苷酶活性，真核生物 28S rRNA 上第 A4之间的 N-C 糖苷键几乎能被大部分的核糖体失活蛋白水放，从而使延长因子 EF-2 不能跟核糖体结合，最终阻止NA 水解酶活性，研究表明，，核糖体 28S rRNA 第 G432键能够被部分核糖体失活蛋白专一性的切割，在 3’端切白构象发生改变，进而导致 tRNA 和核糖体无法结合，有研究发现，从巨曲霉（Aspergillus giganteus）中分离出种 RNase。最新的研究表明，苦瓜中的 α-苦瓜素和 β-苦A 的功能[70]。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.41

【参考文献】