GATA-6过表达和干扰载体的构建及其对鹅颗粒细胞类固醇合成及相关基因的调控研究

发布时间：2020-07-07 05:59

【摘要】：GATA家族是能与靶基因核酸的共同序列(A/T)GATA(A,G)相结合的转录因子,其核心成员GATA-4和GATA-6主要表达于动物卵巢颗粒细胞和膜细胞中,GATA-4和GATA-6被证实在人、小鼠以及猪的卵巢中均共同参与调控类固醇激素的合成过程。目前对GATA-4调控卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的机理已经进行了大量的研究,但GATA-6在鹅以及其他物种卵巢中的功能研究却还没有报道。因此,本研究以天府肉鹅母系为实验材料,首先构建鹅GATA-6干扰载体和过表达载体；其次通过干扰和过表达GATA-6基因,分析其对颗粒细胞类固醇合成及相关基因的调控作用；最后通过共转染GATA-4和GATA-6过表达载体,探讨两者在颗粒细胞中的作用差异及可能的相互作用关系。主要研究结果如下：(1)通过RT-PCR、克隆测序以及序列拼接获得天府肉鹅GATA-6基因完整编码区序列1173bp,预测其共编码390个氨基酸,序列提交至NCBI数据库,其登陆号为：KP723851。(2)CCK结果表明：过表达GATA-6基因后,鹅卵巢颗粒细胞增殖率上升；而干扰GATA-6基因表达后,颗粒细胞增殖率下降；由此表明GATA-6能够正向调控颗粒细胞增殖。(3)与空白组及空载组相比,干扰GATA-6基因表达后,胆固醇和孕酮的分泌量显著增加(p0.05),而其下游靶基因3β-HSD.cyp17、P450scc.17β-HsD表达量显著降低(p0.05),Cyp19、StAR显著上升(p0.05),而FSHR无明显变化(p0.05)。故表明3β-HSD、Cyp19、Cyp17、P450scc、17β-HSD、stAR是GATA-6在卵泡发育过程中参与调控转录的下游靶基因,并通过调控相关靶基因转录间接调节类固醇激素的合成。(4)与空白组及空载组相比,过表达GATA-6基因后,孕酮分泌量增加(p0.05),胆固醇分泌量降低(p0.05),睾酮分泌量极显著减少(p0.01)；而其下游靶基因3β-HSD和Cyp19以及FSHR的表达量极显著下降(p0.01),17β-HSD显著下降(p0.05), Cyp17和StAR的表达量极显著上升(p0.01), P450scc的表达量虽然呈上升趋势但是差异不显著(p0.05)。此外,GATA-4基因表达量无显著性的变化,所有空白组和对照组之间没有显著的变化(p0.05)。比较干扰和过表达实验的结果,表明GATA-6对于调控下游靶基因存在差异性的调控模式；而转录因子GATA-6对转录因子GATA-4的表达量的影响没有差异性的影响。(5)与空白组以及对照组相比,共转染GATA-4和GATA-6真核表达载体后,胆固醇的分泌量显著增加(p0.05),孕酮分泌量增加但差异不明显(p0.05),睾酮分泌量显著减少(p0.05)。而下游靶基因3β-HSD、Cyp19以及FSHR的表达量显著升高(p0.05),17β-HSD虽然表达量上升但差异不显著(p0.05), Cyp17和P450scc表达量极显著降低(p0,01), StAR表达量显著降低(p0.05)；所有空白组和对照组没有发生显著的变化(p0.05)。故表明GATA-4和GATA-6在卵泡中类固醇合成相关靶基因的调控作用既存在拮抗作用又存在补偿代谢机制。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S835

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