兽疫链球菌ATCC39920诱导表达系统的构建及应用

发布时间：2020-08-25 17:08

【摘要】：透明质酸(Hyaluronic acid, HA)是一种线性、大分子量粘多糖,被广泛应用于医药、化妆品等行业。兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)是工业发酵生产HA的主要菌株,研究其生物学和代谢机理具有重要意义。基因调控表达是揭示基因功能的有效手段,对兽疫链球菌尚缺乏基因诱导表达系统,严重阻碍基因功能的研究。本研究以兽疫链球菌ATCC39920为研究对象,报道四种基于质粒调控的诱导表达系统：蔗糖、乳糖、木糖和乳酸链球菌素(nisin)调控的诱导表达系统；并以编码透明质酸合成酶的hasA基因作为报告基因,以hasA基因功能缺失导致荚膜缺陷的hasA作为宿主菌,观察诱导后荚膜生成情况验证系统的可行性；依据AhasA的特性建立可控的两步法产HA的发酵模式。主要研究结果如下：1、构建兽疫链球菌ATCC39920稳定复制的质粒以pSET4s质粒为出发载体,成功构建大肠杆菌-兽疫链球菌穿梭质粒pLH200,其拥有来源于pWV01质粒的repA基因和用于筛选的壮观霉素抗性标记。包含pLH200质粒的兽疫链球菌在无抗生素压力条件下培养24 h, pLH200质粒丢失率为0%,表明此质粒用于基础研究的同时可避免使用抗生素引起的耐药性变异。2、构建并分析四种诱导表达系统以pLH200质粒为出发载体,插入scrR-PScrA调控元件,构建蔗糖诱导表达质粒,在PscrA下游插入报告基因hasA,构建蔗糖调控hasA表达质粒pLH200::scrR-PscrA::hasA(pLH201)。分别用lacR-PlacA、xylR-PxylA和nisin-nisR-PnisA调控元件替换scrR-PscrA构建乳糖、木糖、nisin调控的诱导表达质粒。四种诱导系统可行性分析表明：乳糖系统诱导表达效率低；木糖和nisin系统不能诱导基因表达；蔗糖系统可严谨且高效诱导基因表达,此诱导系统的成功构建为开展兽疫链球菌基因功能的研究夯实了基础。3、建立可控的两步法产HA的发酵模式将pLH201质粒电转化入△hasA菌株中,构建△hasA/pLH201菌株。此菌株在以葡萄糖为糖源的培养基中不能合成荚膜,解除高粘度发酵液对溶氧和基质传递的限制；其在蔗糖诱导下恢复合成荚膜的能力。据此本论文提出可控的两步发酵模式：在0.12h添加初始浓度为30 g／L的葡萄糖,意在获得高密度菌体。在12-24 h添加初始浓度为20g/L的蔗糖,意在诱导合成荚膜,收获HA。经两步发酵后,△hasA/pLH201的HA产量为3.4 g／L,而△hasA几乎检测不到HA。△hasA/pLH201生物量为2.7 g／L,期望通过深入研究提高其菌体密度,利用此发酵模式必将提高HA产量。
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S852.611

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本文编号：2803962